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2018, 35(5):384-388.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17690

基准剂量法评估低剂量氯乙烯亚慢性染毒致肝毒性的生物接触限值


a. 山西医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室, 山西 太原 030001 ;
b. 山西医科大学基础医学院病理学教研室, 山西 太原 030001

收稿日期: 2017-11-17;  发布日期: 2018-07-06

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:81773405);山西省留学基金研究项目(编号:2016-056);山西省自然科学基金项目(编号:20140110436)

通信作者: 仇玉兰, Email: ylqiu@sina.com  

作者简介: 张林(1990-), 女, 硕士生; 研究方向:卫生毒理学; E-mail:

[目的] 应用基准剂量(BMD)法分析氯乙烯低剂量亚慢性染毒的肝脏毒效应,估算其BMD、基准剂量下限值(BMDL),为低剂量氯乙烯的亚慢性肝毒性的风险评估提供资料。

[方法] 48只ICR雄性小鼠分为氯乙烯高浓度组(160 mg/m3)、中浓度组(80 mg/m3)、低浓度组(40 mg/m3)和阴性对照组,每组12只,静式吸入染毒10周,每周染毒5次,每次2 h。观察记录小鼠体重变化,行肝脏病理学检查,测定肝脏系数、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肝脏三酰甘油(TG)及胆固醇(CHO)含量。根据BMD法筛选肝脏毒性效应数据,采用BMDS 2.7软件中连续型变量的4种剂量-效应关系模型(Hill、Linear、Polynomial和Power模型)对筛选后的实验数据进行拟合,选择最佳拟合模型,得出BMD和BMDL值。

[结果] 对照组和低浓度组小鼠肝脏病理学检查未观察到异常改变,中、高浓度组出现明显的肝细胞水肿、嗜酸性改变及炎细胞浸润。与对照组相比,染毒组的起始体重、终末体重、肝脏系数、血清ALT、AST及肝脏TG差异均无统计学意义(P>0.05);高、中浓度组肝脏CHO含量[(1 836.86±179.89)、(1 944.20±213.45)mmol/g]均高于低浓度组及对照组[(1 176.65±73.91)、(1 085.10±211.95)mmol/g],且差异具有统计学意义(P < 0.05)。将肝脏CHO含量采用BMD法进行分析,选择最敏感模型Hill模型计算得出BMD和BMDL分别为38.96、16.48 mg/m3。氯乙烯的未观察到有害作用水平(NOAEL)为40 mg/m3

[结论] 低浓度氯乙烯亚慢性染毒导致小鼠肝脏脂质代谢紊乱,且BMD和BMDL值均低于NOAEL。

关键词: 氯乙烯;  肝毒性;  剂量-效应关系;  基准剂量;  基准剂量下限值;  未观察到有害作用水平 

氯乙烯(vinyl chloride)主要用于合成聚氯乙烯,2013年我国已成为聚氯乙烯第一大生产和消费国,而且在全世界220万接触氯乙烯的工人[1]中,我国占有较大比例。近些年氯乙烯职业暴露浓度大幅降低,但有研究发现氯乙烯工人脂肪肝或肝脏脂肪代谢紊乱发病率明显高于非暴露人群[2]。随着氯乙烯及聚氯乙烯产品的广泛应用,生活饮用水及周围空气中也存在一定浓度的氯乙烯[3-6]。以往对化学物毒性的生物接触限值评估是以未观察到有害作用水平(no observed adverse effect level,NOAEL)为基础,由于其有一定局限性,CRUMP [7]于1984年提出了基准剂量(benchmark dose,BMD)法代替NOAEL法。BMD指依据特定剂量-效应关系,求得引起某一特定水平反应(基准剂量反应,定性资料为5%,定量资料为10%)所对应的剂量,其单侧95%可信区间下限值(benchmark dose lower limit,BMDL)通常可代替NOAEL去推导生物接触限值。目前BMD的研究主要集中在生殖发育、神经毒性、遗传毒性、内分泌系统异常及流行病学等方面[8-10],有关化学物的亚慢性肝毒性研究较少。本研究采用BMD法探讨氯乙烯低剂量亚慢性染毒致肝毒性的生物接触限值,并与NOAEL法比较。

1   材料与方法

1.1   主要试剂及仪器

1.1.1   试剂

氯乙烯气体(纯度99.99%,太原化学股份有限公司氯碱分公司,中国),无水乙醇(天津市北辰方正试剂厂,中国),总胆固醇(total cholesterol,T-CHO)测试盒、三酰甘油(triglyceride,TG)测试盒(南京建成生物工程研究所,中国),二辛可宁酸(BCA)蛋白定量试剂盒(博士德生物工程有限公司,美国)。

1.1.2   仪器

动物天平(意欧仪器仪表有限公司,中国),Konelab PRIME 30全自动生化分析仪(Thermo Fisher,美国),DNM-9602G酶标仪(北京普朗新技术有限公司,中国),低温高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司,中国)。

1.2   动物与分组

48只6~8周龄的雄性SPF级ICR小鼠,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号为SCXK(京)2012-0001。动物的使用和管理符合动物保护委员会(山西医科大学伦理委员会)的标准。将48只小鼠按体重随机分成4组,根据职业人群氯乙烯职业接触限值(10 mg/m3)及每日工作时间(8 h),分别设置高(160 mg/m3)、中(80 mg/m3)、低(40 mg/m3)氯乙烯质量浓度(后称浓度)染毒组和阴性对照组,每组12只。

1.3   染毒

采用静式吸入染毒(50 L体积,4个静式染毒柜),每周5次,每次染毒2 h,每组(12只)分两批染毒,每个柜子染毒6只小鼠。将小鼠放进染毒柜中,加盖,用注射器将吸好的一定体积的氯乙烯气体(根据染毒柜的体积、染毒时间及染毒浓度计算各组所需要的氯乙烯气体的体积分别为3.72、1.86、0.93 mL),从加药口打进染毒柜,封口,开启盖子上的小风扇,同时开始计时,观察并记录中毒症状。小鼠于实验第10周末处死,取其血清和肝脏。

1.4   BMD计算

1.4.1   筛选数据

在实验设计及结果数据合理可靠的前提下,参照吴智君等[11]的方法选择具有肝毒理学意义、统计学意义和剂量-效应趋势的毒效应数据。本研究选择的具体效应指标包括血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)和肝脏TG、CHO。

1.4.2   选择最佳剂量-效应模型

使用美国环境保护署(EPA)提供的BMDS 2.7软件,采用BMDS中连续型变量的4种剂量-效应关系模型(Hill、Linear、Polynomial和Power模型)对筛选后的实验数据进行拟合,遵循拟合优度检验P > 0.05且赤池信息量准则(Akaike information criterion,AIC)系数最小的原则选择最佳拟合模型[8-11]。基准剂量反应为10%,可信度选取5%,计算得出氯乙烯亚慢性肝毒性的BMD和BMDL。

1.5   统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行统计分析。满足参数检验要求的数据采用单因素方差分析,数据表示为x±s;不满足条件的用秩和检验,数据表示为MP25P75)。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   基本指标观测

氯乙烯染毒期间,各组小鼠活动及饮食量等正常。随着染毒时间的延长,小鼠体重逐渐增加。至染毒结束时,各组小鼠均未出现明显中毒症状。各组小鼠起始体重、终末体重以及肝脏的脏器系数差异均无统计学意义(P > 0.05)(见表 1)。

表1

各组小鼠体重及肝脏系数(x±sn=12)

Table1.Body weights and liver coefficients of mice

2.2   肝脏组织病理变化

氯乙烯染毒10周后,对照组小鼠肝脏组织病理学检查未观察到任何异常变化,肝细胞大小一致,边界清楚,胞质染色均匀,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,细胞间质无炎性细胞浸润(见图 1A);低浓度组小鼠肝脏组织与对照组相比,无明显异常变化(见图 1B);中浓度组肝脏组织出现细胞水肿(箭头a所示)、少量炎性细胞浸润(箭头b所示)及细胞嗜酸性变化(箭头c所示)(见图 1C);高浓度组胞质疏松,细胞水肿明显,伴有大量炎性细胞浸润(见图 1D)。

图 1

氯乙烯染毒10周小鼠肝脏病理变化(HE染色,×200)

2.3   生化指标检测结果

表 2所示,各组小鼠血清中AST和ALT水平差异均无统计学意义。肝脏中CHO含量呈现随染毒浓度增加而升高的趋势,高、中浓度组与对照组及低浓度组比较差异均有统计学差异(P < 0.05)。而各组小鼠肝脏TG含量比较差异无统计学意义(P > 0.05)。

表2

各组小鼠血清中ALT、AST及肝脏中CHO、TG含量

Table2.Levels of serum ALT, serum AST, liver CHO, and liver TG of mice

2.4   模型拟合氯乙烯浓度与肝脏CHO含量的剂量-效应关系及其BMD和BMDL

根据“ 1.4 BMD计算”描述的指标确定方式,本实验中小鼠肝脏CHO含量升高,差异具有统计学意义,而且呈现随染毒浓度增加而升高的趋势,故选用肝脏CHO指标进行拟合。采用BMDS 2.7软件提供的Hill、Linear、Polynomial和Power 4种连续性变量模型拟合不同浓度下氯乙烯与肝脏CHO含量的剂量-效应关系,并计算得出不同浓度下氯乙烯对小鼠亚慢性肝毒作用的BMD、BMDL、AIC以及拟合优度检验的P值(见表 3)。根据“ 1.4.2”,选择最佳拟合模型为Hill模型(P=0.658,AIC=669.34),剂量-效应模型为$\hat y$=1 085.1+859.1x3/ (102.4+x3)。如图 2显示,随着氯乙烯浓度的升高,肝脏中CHO含量升高,且差异具有统计学意义(F=6.100,P < 0.05)。因此,根据Hill模型可得出不同浓度下氯乙烯亚慢性染毒对小鼠肝脏CHO的BMD和BMDL分别是38.96、16.48 mg/m3

表3

4种模型计算氯乙烯亚慢性肝毒性的BMD、BMDL和AIC

Table3.BMD, BMDL and AIC of vinyl chloride induced subchronic hepatotoxicity by four models

图 2

Hill模型拟合不同浓度氯乙烯与肝脏CHO含量的剂量-效应关系

2.5   经典NOAEL法

根据表 2中肝脏CHO的结果,可知氯乙烯经吸入对小鼠肝脏CHO的NOAEL为40 mg/m3

3   讨论

化学品暴露的危害表征常用的方法有NOAEL和BMD法。NOAEL系在规定暴露下,某种外源化学物不引起实验主体产生可被检测到的有害作用的最高浓度或剂量。传统NOAEL法在风险评估中应用较多,通常用实验得到的NOAEL值计算外推到人的生物接触限值。但是,NOAEL法有许多局限,比如,NOAEL仅仅依靠单个剂量组而确定,未考虑各实验组的剂量-效应关系曲线斜率,同时其对实验样本量的依赖性较强,而且在长期慢性实验中较难获得NOAEL值[10]。因此,在1984年CRUMP [7]提出用BMD法代替NOAEL法,BMD法在进行评估时充分利用所有的实验数据,根据数据类型选择合适的剂量-效应模型来拟合数据(适用于任何类型的剂量-效应关系),且对实验剂量设计依赖性较小,在对数据不确定性进行量化后,计算出BMD和BMDL,用更为精确的BMDL代替NOAEL。

氯乙烯作为一种多器官、多系统的化学毒物,主要靶器官是肝脏,其能够引起肝脏的良性和恶性病变,如化学性肝脏脂肪变性[12]、肝细胞癌和肝血管肉瘤[13]等。肝脏是体内CHO代谢的重要场所,涉及通过胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)参与CHO的合成和摄取血清CHO及分泌CHO参与胆汁的生成。低剂量长期接触氯乙烯可引起脂质代谢紊乱。根据本次实验结果,肝脏CHO含量有随染毒浓度增加而升高的趋势,且差异具有统计学意义。因此,本次研究中,BMD法采用Hill、Linear、Polynomial和Power 4种模型对肝脏CHO指标进行拟合。选择最优拟合模型Hill模型,并计算得出了氯乙烯对小鼠肝脏CHO的BMD和BMDL分别为38.96、16.48 mg/m3。本实验得出,不同浓度氯乙烯经吸入式亚慢性染毒对小鼠肝脏CHO的NOAEL为40 mg/m3,其实NOAEL值应该在低、中剂量之间(40~80 mg/m3)。根据此次实验设计及结果得出的NOAEL值,可能与真实的NOAEL值并不一致,这说明依据实验设计不同可能得出不同的NOAEL值[10-14]

本实验中小鼠肝毒性的BMDL比NOAEL偏小,即BMDL较NOAEL更为敏感。有学者曾应用BMD法研究职业性氯乙烯接触所致遗传损伤,得到的BMD和BMDL分别为7.2、2.86 mg/(m3·年)[9]。考虑到实际职业接触中主要是男性职工[15],故本次研究中只采用了雄性小鼠,得到的BMD和BMDL分别为38.96、16.48 mg/m3;考虑到种属差异及个体间差异,不确定系数假定是100,将BMD和BMDL外推到人分别为0.3896、0.1648mg/m3。自20世纪70年代以后,国外对氯乙烯的职业接触限值做了相应的调整,规定其时间加权平均容许浓度为1ppm [2.79mg/m3] [16],随后我国也将氯乙烯职业卫生标准调整为10mg/m3。根据本次实验结果,我国氯乙烯的职业接触限值仍较高,今后在条件许可的情况下是否需要进一步降低限值值得探讨。

在本次实验中,应用BMD法评估低浓度氯乙烯亚慢性染毒对小鼠肝脏的毒性作用,同时将其与传统NOAEL法进行比较。BMD法有很多优点,但在应用上也存在诸多问题,如其需要构建适宜的剂量-效应关系模型,运用较为复杂的统计学方法,而且对数据也有一定的要求[10-17]。因此,需要评估者完善实验设计,掌握更多技巧及投入更多精力去处理数据,同时不断开发和改进BMD方法,才能保证数据分析的精确性与合理性。

表1

各组小鼠体重及肝脏系数(x±sn=12)

Table 1 Body weights and liver coefficients of mice

图 1

氯乙烯染毒10周小鼠肝脏病理变化(HE染色,×200)

Figure 1 Liver histopathological changes in mice treated with vinyl chloride for 10 weeks

[注]a:细胞水肿;b:炎性细胞;c:细胞嗜酸性改变。A:对照组;B:低浓度组;C:中浓度组;D:高浓度组。 [Note]a: Hepatocyte edema; b: Inflammatory cell; c: Hepatocyte eosinophilic change. A: Control group; B: Low concentration group; C: Medium concentration group; D: High concentration group.
表2

各组小鼠血清中ALT、AST及肝脏中CHO、TG含量

Table 2 Levels of serum ALT, serum AST, liver CHO, and liver TG of mice

表3

4种模型计算氯乙烯亚慢性肝毒性的BMD、BMDL和AIC

Table 3 BMD, BMDL and AIC of vinyl chloride induced subchronic hepatotoxicity by four models

图 2

Hill模型拟合不同浓度氯乙烯与肝脏CHO含量的剂量-效应关系

Figure 2 Dose-effect relationship of vinyl chloride against liver CHO of mice in Hill model

参考文献

[1]

BRANDT-RAUF P W, LI Y, LONG C, et al. Plastics and carcinogenesis:the example of vinyl chloride[J]. J Carcinog, 2012, 11:5.

[2]

黎燕, 王祖兵, 吴炜.长期低浓度接触氯乙烯工人疾病谱分析[J].中国工业医学杂志, 2013, 26(4):294-296.

[3]

AL-MALACK M H, SHEIKHELDIN S Y. Effect of solar radiation on the migration of vinyl chloride monomer from unplasticized PVC pipes[J]. Water Res, 2001, 35(14):3283-3290.

[4]

RUCKART P Z, BOVE F J, MASLIA M. Evaluation of exposure to contaminated drinking water and specific birth defects and childhood cancers at Marine Corps Base Camp Lejeune, North Carolina:a case-control study[J]. Environ Health, 2013, 12:104.

[5]

BOVE F J, RUCKART P Z, MASLIA M, et al. Evaluation of mortality among marines and navy personnel exposed to contaminated drinking water at USMC base Camp Lejeune:a retrospective cohort study[J]. Environ Health, 2014, 13(1):10.

[6]

BOVE F J, RUCKART P Z, MASLIA M, et al. Mortality study of civilian employees exposed to contaminated drinking water at USMC Base Camp Lejeune:a retrospective cohort study[J]. Environ Health, 2014, 13:68.

[7]

CRUMP K S. A new method for determining allowable daily intakes[J]. Fundam Appl Toxicol, 1984, 4(5):854-871.

[8]

顾刘金, 孙建析, 杨校华, 等.基准剂量法在咪鲜胺锰盐亚慢性毒性研究中的应用[J].环境与职业医学, 2005, 22(1):28-32.

[9]

郝延慧, 王威, 仇玉兰, 等.氯乙烯遗传毒性及其基准剂量在职业接触限值中的应用[J].中国工业医学杂志, 2012, 25(6):414-418.

[10]

彭辉, 李巧芳, 殷健, 等.基准剂量法在长期暴露毒性评价中的研究进展[J].军事医学, 2016, 40(10):851-855.

[11]

吴智君, 赵文锦, 郑敏, 等.基准剂量法在90 d经口毒性试验中的应用[J].毒理学杂志, 2016, 30(3):205-209.

[12]

WAHLANG B, BEIER J I, CLAIR H B, et al. Toxicantassociated steatohepatitis[J]. Toxicol Pathol, 2013, 41(2):343-360.

[13]

GUIDO M, SARCOGNATO S, PELLETTI G, et al. Sequential development of hepatocellular carcinoma and liver angiosarcoma in a vinyl chloride-exposed worker[J]. Hum Pathol, 2016, 57:193-196.

[14]

SLOB W. Benchmark dose and the three Rs. Part I. Getting more information from the same number of animals[J]. Crit Rev Toxicol, 2014, 44(7):557-567.

[15]

张晓星, 张桂云, 肖经纬, 等.氯乙烯接触工人肿瘤标志物水平[J].卫生研究, 2017, 46(6):950-955.

[16]

CAVE M, FALKNER K C, RAY M, et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers[J]. Hepatology, 2010, 51(2):474-481.

[17]

方瑾, 贾旭东.基准剂量法及其在风险评估中的应用[J].中国食品卫生杂志, 2011, 23(1):50-53.

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:81773405);山西省留学基金研究项目(编号:2016-056);山西省自然科学基金项目(编号:20140110436)

[作者简介] 张林(1990-), 女, 硕士生; 研究方向:卫生毒理学; E-mail: zhanglin910503@163.com

[收稿日期] 2017-11-17 00:00:00.0

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