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2018, 35(5):443-446.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17676

三丁基锡暴露对斑马鱼体脂的影响


1. 浙江省化工研究院有限公司生测安评中心, 浙江 杭州 310023 ;
2. 浙江大学营养学食品安全研究所, 浙江 杭州 310058

收稿日期: 2017-11-14;  发布日期: 2018-07-06

基金项目: 浙江省科技计划项目(编号:2018C37119,2017F10033)

通信作者: 朱心强, Email: zhuxq@zju.edu.cn  

作者简介: 徐剑(1982-), 男, 学士, 助理研究员; 研究方向:农药化学品毒理检测; E-mail:

[目的] 研究三丁基锡对斑马鱼体脂的影响。

[方法] 采用受精后7 d的AB品系斑马鱼设空白对照、溶剂对照及3个试验组,每组100尾,试验组剂量分别为12.5、25.0、50.0 ng/L三丁基锡,将幼鱼连续染毒至受精后30 d。麻醉后,测量其体质量指数(body mass index,BMI),检测三酰甘油、总胆固醇水平,并通过HE染色观察其肝脏病理变化,冰冻切片油红O染色观察其肝脏脂肪变化。

[结果] 25.0、50.0 ng/L三丁基锡组的体重、BMI、三酰甘油水平较空白对照组升P < 0.01);体重分别为(2.66±0.33)、(3.72±0.58)、(1.16±0.25)mg,BMI分别为(0.07±0.02)、(0.10±0.03)、(0.03±0.01)mg/mm2,三酰甘油水平分别为(24.41±0.80)、(29.47±0.79)、(17.87±0.50)μmol/g(以每g蛋白计)。各剂量组总胆固醇水平与空白对照组间差异无统计学意义。HE染色结果显示25.0、50.0 ng/L剂量组中部分幼鱼肝脂肪变性。50.0 ng/L剂量组中肝组织油红O着色较空白对照组明显加深。

[结论] 三丁基锡可增加斑马幼鱼脂肪水平,具有致肥胖作用。

关键词: 三丁基锡;  斑马鱼;  肥胖;  体质量指数;  肝脂肪变性 

三丁基锡(tributyltin)是环境内分泌干扰物中对哺乳动物有致肥胖作用的一种代表性物质[1-2]。这些化合物在低浓度暴露时, 通过干扰脂肪生成的关键核受体, 改变荷尔蒙的合成和代谢, 从而导致脂肪堆积[3]。作为脊椎动物, 斑马鱼拥有许多与人类相似的结构, 而且斑马鱼基因组与人类基因组具有高度的同源性。尽管斑马鱼缺少棕色脂肪组织, 但它和哺乳动物一样在内脏、肌肉、皮下储存中性脂质三酰甘油(triglyceride, TG), 而这些脂类为肥胖症的表征, 并且其生物代谢转化内环境与哺乳动物一样, 因此非常适合应用于肥胖研究。本研究在斑马鱼幼鱼至发育期进行三丁基锡染毒, 研究三丁基锡对斑马鱼体脂的影响。

1   材料与方法

1.1   试验体系

AB品系斑马鱼(国家斑马鱼资源中心, 中国)种鱼饲养于28.5℃水中, 光暗周期为14 h/10 h, 每天用新鲜孵化的丰年虫投喂2次, 每次1滴(总体积1.5 L)。本次研究采用受精后7 d (7 dpf)幼鱼作为暴露对象。斑马鱼胚胎由雌雄鱼自然交配而得。受精卵置于28.5℃水中孵化, 5 dpf后投喂斑马鱼1段位饲料(30 mg/d), 9 dpf后投喂丰年虫, 14 dpf后在水中曝气饲养。

1.2   主要试剂和仪器

油红O (Sigma, 美国), 苏木素和伊红(广州市秀威贸易有限公司, 中国), 无水乙醇、1, 2-丙二醇(国药集团化学试剂有限公司, 中国), 幼鱼喂养饲料Larval AP100 (Zeigle, 美国), TG和总胆固醇(total cholesterol, TC)检测试剂盒(南京建成生物制品公司, 中国), 光学显微镜(Olympus, 日本), 酶标仪(上海科华实验系统有限公司, 中国), 冰冻切片机(莱卡, 德国)。

1.3   实验方法

1.3.1   染毒

将7 dpf幼鱼随机分为5组, 分别为空白对照组、溶剂对照组及3个试验组, 每组100尾, 饲养于1.5 L水中。OUADAH-BOUSSOUF [4]等在斑马鱼的致肥胖作用研究中表明, 10~50 ng/L为理想的暴露剂量, 故本研究试验组设12.5、25.0、50.0 ng/L 3个剂量。空白对照不做处理, 溶剂对照加入二甲基亚砜, 试验组先将三丁基锡溶解于二甲基亚砜中, 后加入饲养水。溶剂对照及试验组的染毒剂量需提前配制, 并搅拌2 h以上。每天换水2次, 至受精后30 d (30 dpf)。

1.3.2   体质量指数(body mass index, BMI)测量

冰冻麻醉幼鱼, 滤纸吸干其全身水分, 称量体重。用游标卡尺测量幼鱼头部最前端到鱼尾最末端距离, 为身长。BMI=体重(mg)/身长2(mm2)。

1.3.3   HE染色

4%多聚甲醛固定幼鱼4 d后, 常规病理脱水、包埋制成蜡块标本。切5 μm片, 烫片、贴片、烘干后脱蜡, 苏木素染色7 min, 温水蓝化1 min, 浸入1%盐酸酒精中分化60 s左右, 之后放入伊红染液中染色5 min, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树脂封片。显微镜下观察肝脏病理变化, 并拍照保存。

1.3.4   冰冻切片油红O染色

4%多聚甲醛固定幼鱼4 d, 磷酸盐缓冲液冲洗2次, 30%蔗糖浓液(磷酸盐缓冲液配制)浸透4℃过夜, OCT (冰切包埋剂)包埋, 在冰冻切片机中切取8 μm切片, 60℃烤片30 min, 苏木素染液中染色10 s, 自来水分化1min后干燥, 50%乙醇润洗, 油红O乙醇染液作用8min, 50%乙醇分化, 自来水终止分化, 甘油明胶封片。

油红O乙醇染色配制:油红O 0.5 g, 50%乙醇100 mL。将油红O溶于乙醇内, 且不断搅拌至完全溶解即可。配制好的染液置磨口瓶内保存备用。

1.3.5   TG、TC测定

将斑马鱼幼鱼加入1 mL水的组织研磨管中, 研磨后离心, 取上清液, 采用酶标仪法, 用TC、TG试剂盒测量幼鱼体内TC和TG水平。

1.4   统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行方差分析, 并对有差异的个体再行LSD两两比较。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   BMI测量结果

本次研究中, 斑马鱼的存活率在75%~83%之间, 各剂量组与空白对照组相比, 差异无统计学意义。如表 1所示, 三丁基锡25.0、50.0 ng/L剂量组的体重、BMI高于空白对照组(P < 0.01)。溶剂对照组斑马鱼的体重、身长、BMI值与空白对照组相比, 差异无统计学意义。

表1

三丁基锡喂养至30dpf斑马鱼BMI改变(x±s)

2.2   HE染色结果

图 1所示, 三丁基锡50.0 ng/L剂量组中部分幼鱼肝细胞脂肪变性, 弥漫性肝细胞胞质内出现较大脂肪空泡, 胞质较亮, 胞核被推向一侧。肝脂肪变性率为13.3%。三丁基锡25.0 ng/L剂量组也出现肝细胞脂肪变性, 三丁基锡12.5 ng/L剂量组、空白对照组、溶剂对照组未见肝脂肪变性(图片未列出)。

图 1

50.0ng/L三丁基锡喂养至30dpf斑马鱼幼鱼的肝组织HE染色结果(×400)

2.3   冰冻切片油红O染色结果

图 2所示, 三丁基锡50.0 ng/L剂量组中斑马鱼幼鱼肝区油红O着色明显深于空白对照组。

图 2

喂养至30 dpf斑马鱼幼鱼的肝组织油红O染色结果(×100)

2.4   TG、TC测定结果

表 2所示, 三丁基锡25.0、50.0 ng/L剂量组的TG水平均高于空白对照组, 差异有统计学意义(P < 0.01)。溶剂对照组的TG水平与空白对照组相比, 差异无统计学意义。各剂量组TC水平与空白对照组间差异无统计学意义。

表2

喂养至30 dpf斑马鱼幼鱼TG、TC水平(μmol/g)

3   讨论

三丁基锡因其特有的理化性质可用作木材防腐剂, 船体涂料的防污剂, 纺织业、工业水系统、木浆和造纸系统以及啤酒厂的抑菌剂。大量实验研究表明, 三丁基锡会对人体及动物造成危害, 主要包括神经毒性、免疫毒性、肝毒性和生殖毒性等[5]; 而对于致肥胖作用, 目前国内研究尚少。

有证据表明, 外部环境对婴幼儿时期脂肪堆积的影响远大于成人[6]。因此, 本次研究选用斑马鱼相对比较敏感的7~30 dpf, 相当于人类的婴幼儿时期。斑马鱼在7dpf后由卵分化成全鱼, 30dpf后其组织、器官基本形成, 且该时间段斑马鱼的成活率相对较高。

本研究中, 三丁基锡25.0、50.0 ng/L剂量组的BMI为空白对照组的2.25、3.28倍。BMI是临床医学界定肥胖症的一个重要指标, 但斑马鱼的BMI与人存在一定差异, 因此, 本研究选择HE染色、油红O染色、TG值、TC值等一些辅助指标的测定进行佐证。HE染色结果显示三丁基锡50 ng/L剂量组有明显肝脂肪变性现象, 油红O染色结果显示其肝区油红O着色程度也较空白对照深。25.0、50.0 ng/L剂量组TG值明显升高, 分别为空白对照的1.37、1.65倍。这提示在斑马鱼幼鱼至发育期染毒25.0、50.0 ng/L三丁基锡, 对斑马鱼有致肥胖作用。

斑马鱼体内仅有白色脂肪组织, 没有棕色脂肪组织[7], 而白色脂肪组织中最多的就是TG, 因此, 一旦出现肥胖, TG水平一定升高。TG囤积最多、最明显的地方为肝脏。本实验中油红O染色印证了这一点, 即肝区的着色程度较其他部位深。而TC一般存在于血液、神经、胆汁中, 在斑马鱼中存在量相对较低, 在本研究中未见明显变化。

综上所述, 在25.0、50.0 ng/L染毒剂量下, 三丁基锡对斑马鱼体脂有影响, 提示在三丁基锡暴露的环境中, 存在致肥胖的风险, 尤其是婴幼儿时期。本次研究仅对三丁基锡致肥胖作用进行研究, 未对其致肥胖机制进行探讨。三丁基锡是一种有致肥作用的环境内分泌干扰物, MARTELLA等[8]的研究表明双酚A也能导致斑马鱼脂肪肝。因此, 此类内分泌干扰物对斑马鱼致肥作用的影响是今后研究的方向。

表1

三丁基锡喂养至30dpf斑马鱼BMI改变(x±s)

Table 1
图 1

50.0ng/L三丁基锡喂养至30dpf斑马鱼幼鱼的肝组织HE染色结果(×400)

Figure 1 [注]箭头所指为肝细胞脂肪变性。
图 2

喂养至30 dpf斑马鱼幼鱼的肝组织油红O染色结果(×100)

Figure 2 [注]A:空白对照组; B: 50.0 ng/L三丁基锡组。
表2

喂养至30 dpf斑马鱼幼鱼TG、TC水平(μmol/g)

Table 2

参考文献

[1]

NEWBOLD R R, PADILLA-BANKS E, JEFFERSON W N, et al. Effects of endocrine disruptors on obesity[J]. Int J Androl, 2008, 31(2):201-208.

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JANESICK A, BLUMBERG B. Endocrine disrupting chemicals and the developmental programming of adipogenesis and obesity[J]. Birth Defects Res C Embryo Today, 2011, 93(1):34-50.

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OUADAH-BOUSSOUF N, BABIN P J. Pharmacological evaluation of the mechanisms involved in increased adiposity in zebrafish triggered by the environmental contaminant tributyltin[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2016, 294:32-42.

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SPALDING K L, ARNER E, WESTERMARK P O, et al. Dynamics of fat cell turnover in humans[J]. Nature, 2008, 453(7196):783-787.

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MARTELLA A, SILVESTRI C, MARADONNA F, et al. Bisphenol a induces fatty liver by an endocannabinoidmediated positive feedback loop[J]. Endocrinology, 2016, 157(5):1751-1763.

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[基金项目] 浙江省科技计划项目(编号:2018C37119,2017F10033)

[作者简介] 徐剑(1982-), 男, 学士, 助理研究员; 研究方向:农药化学品毒理检测; E-mail: xu_jian@sinochem.com

[收稿日期] 2017-11-14 00:00:00.0

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