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2018, 35(4):303-308.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17668

碲化镉量子点对雄性小鼠精子质量和睾丸组织的毒性效应


内蒙古科技大学包头医学院公共卫生学院, 内蒙古 包头 014040

收稿日期: 2017-11-09;  发布日期: 2018-07-06

基金项目: 内蒙古自治区自然科学基金项目[编号:2016MS(LH)0827];内蒙古自治区高等学校科学研究项目(编号:NJZY16217);包头市科技计划项目(编号:CX2017-50);包头医学院科学研究基金项目(编号:BYJJ-QM201639)

通信作者: 张凌燕, Email: zhanglingyan680@139.com  

作者简介: 张凌燕(1986-), 女, 硕士, 讲师; 研究方向:纳米毒理学; E-mail:

[目的] 探讨碲化镉量子点(CdTe quantum dots,CdTe QDs)对雄性小鼠精子质量和睾丸组织的影响。

[方法] 将32只雄性ICR小鼠随机分为4组,分别为对照组(pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液)和低剂量(0.3μmol/kg)、中剂量(0.9 μmol/kg)和高剂量(2.7 μmol/kg)(以体重计,余同)CdTe QDs染毒组,每组8只。采用腹腔注射法隔日染毒1次,染毒3周。检测小鼠体重、生殖器官脏器系数、精子数量和精子畸形率、睾丸组织病理学及睾丸组织中乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性变化情况。

[结果] 染毒后,各组小鼠体重差异均无统计学意义(P>0.05)。高剂量组小鼠睾丸脏器系数低于对照组(P < 0.05)。各组小鼠睾丸重量、附睾重量及脏器系数差异均无统计学意义(P>0.05)。各剂量组小鼠精子数量与对照组[(3.35±0.76)×107/g]比较均减少(P < 0.05),高剂量组精子数量[(1.08±0.34)×107/g]比中剂量组[(1.73±0.61)×107/g]、低剂量组[(2.37±0.91)×107/g]减少(P < 0.05)。中剂量组[(13.09±3.09)%]、高剂量组[(18.29±2.25)%]小鼠精子畸形率与对照组[(4.16±0.53)%]、低剂量组[(5.07±0.83)%]比较均升高(P < 0.008);高剂量组与中剂量组比较,其精子畸形率升高(P < 0.008)。睾丸组织病理学观察结果显示,各剂量组染毒小鼠睾丸组织出现不同程度损伤。与对照组比较,各剂量组小鼠睾丸LDH和SOD活性无明显变化(P>0.05),SDH活性下降(P < 0.05)。

[结论] CdTe QDs会导致雄性小鼠精子数量减少,精子畸形率升高,睾丸组织受损以及睾丸SDH活性下降。

关键词: 碲化镉量子点;  雄性小鼠;  生殖;  睾丸;  精子 

量子点(quantum dots,QDs)是一种由Ⅱ~Ⅵ族元素或Ⅲ~Ⅴ族元素组成的新型荧光纳米材料。由于QDs具有独特的光学性能和理化性质,被广泛应用于细胞成像[1]、肿瘤诊治[2]、生物检测[3-4]等生物医学领域。此外,因为QDs具有独特的光电学性能,在太阳能电池、电视、激光器及其他光电器件方面也有着极其广泛的应用。然而,由于QDs的尺寸效应、量子效应和巨大的比表面积,其极容易透过各种生物屏障进入机体。随着QDs应用领域的扩大和研究的不断深入,QDs对生态环境以及生物体可能产生的影响及其安全性评价也引起各界的关注。

随着工业环境和生态环境的不断变化,有关人类生殖健康状况下降的问题日益凸显,生殖系统疾病将很有可能成为继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后的第三大社会疾病。已有研究显示,全球成年男性的精液质量呈下降趋势。CARLSEN等[5]的研究结果显示,全球男性平均精子密度从1940年的113×106/mL下降至1990年的66×106/mL,平均精液量从3.40 mL下降至2.75 mL。黄莉萍等[6]的研究结果显示1984— 2009年间中国正常男性精子密度、精子总数和精子正常形态率均呈下降趋势。近年来研究发现,纳米材料如纳米二氧化硅、纳米银等,可能通过血液循环、血睾屏障在睾丸中积累,对睾丸间质细胞造成一定的细胞毒性,进而导致生殖系统损伤[7-9],而碲化镉(CdTe)QDs对生殖系统影响的研究少见报道。

本实验拟用CdTe QDs对雄性小鼠进行染毒,检测小鼠生殖器官脏器系数、附睾精子数量和精子畸形率、睾丸组织病理学及睾丸中酶活性等指标,研究CdTe QDs对雄性小鼠睾丸组织和精子质量的影响并探讨其作用机制,为CdTe QDs在生物医学领域进一步的应用研究和保护接触人群的生殖健康提供理论基础和实验数据。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   实验动物

6周龄成年雄性SPF级ICR小鼠32只,购自北京方缘实验动物养殖中心,体重19~21 g。实验动物质量合格证号为No.11401500010308。适应性饲养1周,8只/笼,2 d更换一次垫料。饲养温度21~25℃,相对湿度21%~25%。实验期间动物自由摄食饮水。动物维持饲料为北京科澳协力饲料有限公司生产。

1.1.2   仪器

DZKW-D-2恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂,中国),TGL20-8高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司,中国),T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司,中国),UV-2600紫外可见分光光度计(岛津公司,日本),F-4600型荧光分光光度计(日立公司,日本),ES220A分析天平(千分之一,Precise,瑞士),高纯氮气(≥ 99.999%,配备氮气压力表和导气软管,上海浦江特种气体有限公司,中国),MS-H-Pro加热磁力搅拌器(上海京工实业有限公司,中国),SZCL-3B数显智能控温磁力搅拌器(电热套式,搅拌容量250 mL,巩义市矛华仪器有限责任公司,中国),DLSB-5/20低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司,中国),Tecnai G2 20场发射型透射电子显微镜(FEI,荷兰)。

1.1.3   试剂

碲粉(高纯试剂,99.999%)、氯化镉(分析纯)、硼氢化钾(分析纯)、还原型谷胱甘肽(生物试剂)、L-半胱氨酸(生物试剂)均购自国药集团化学试剂有限公司。总蛋白定量测试盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测试盒、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)测试盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)测试盒均购自南京建成生物工程研究所。其他试剂均为国产分析纯试剂。整个实验过程用水均为18.2 MΩ的超纯水。

1.2   方法

1.2.1   CdTe QDs的合成

将63.5 mg碲粉和82 mg硼氢化钾混合后加入1 mL超纯水,在MS-H-Pro加热磁力搅拌器上以220 r/min搅拌至黑色的碲粉逐渐消失,溶液变为无色,反应产物为碲氢化钾和硼酸钾。分别称量0.232 g水合氯化镉、0.096 5 g还原型谷胱甘肽和0.1215g L-半胱氨酸于250mL三口烧瓶中,加入200mL超纯水。在氮气保护和磁力搅拌下,用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为9.0。将合成好的碲氢化钾溶液注入氯化镉反应体系中,加热至50℃,打开冷却循环水,待温度升高到96℃时开始计时,回流1 h,即得CdTe QDs溶液,冷却至室温后4℃避光保存。

1.2.2   CdTe QDs的纯化和测定

CdTe QDs的纯化流程如图 1所示。纯化后的CdTe QDs溶液采用UV-2600紫外-可见分光光度计和F-4600型荧光分光光度计测定其紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。将纯化后的CdTe QDs溶液滴加至铜网上,吸附10 min后,用0.5%(质量分数)的磷钨酸溶液染色30 s,水洗30 s,室温下干燥后于Tecnai G2 20场发射型透射电子显微镜上成像。

图 1

CdTe QDs纯化流程图

1.2.3   实验动物分组及染毒

适应性饲养后的小鼠随机分为4组,以CdTe QDs一次性染毒2.5 μmol/kg(以体重计,后同)后对小鼠睾丸组织酶活性产生一定影响为依据[10],分别设置对照组(pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液)、低剂量(0.3 μmol/kg)、中剂量(0.9 μmol/kg)和高剂量(2.7 μmol/kg)CdTe QDs染毒组,每组8只。染毒方式为腹腔注射染毒,注射体积为5 mL/kg(以体重计),隔日染毒1次,共染毒3周。

1.2.4   小鼠一般状况检查

实验期间,每日观察小鼠的一般状况,包括精神状态,皮毛色泽,四肢张力,口、鼻、眼睛、会阴等部位是否有分泌物、红肿等异常状况。

1.2.5   小鼠体重及脏器系数的测定

末次染毒24 h后,各组小鼠称重,处死后取双侧睾丸、附睾称重,计算睾丸、附睾脏器系数。

1.2.6   小鼠精子数量和精子畸形率的测定

取各组小鼠附睾,放于盛有0.5 mL、37℃预热生理盐水的离心管中,用眼科剪剪碎,37℃下保温5 min,使精子自由游出,制得精子悬液,在37℃水浴中孵育待用。取精子悬液50 μL,用生理盐水350 μL稀释混匀。取10 μL稀释后的精子悬液,血球计数板计数,并计算1 g附睾中精子总数。

另取30 μL精子悬液涂片,甲醇固定5 min,干燥后用质量分数1%伊红染色液染色,自然晾干后,采用盲法阅片,计数结构完整精子,并计算精子畸形率。

1.2.7   小鼠睾丸组织的病理学检查

取小鼠右侧睾丸置于10 mL离心管内,加入10%(体积分数)中性福尔马林缓冲溶液固定,常规脱水,石蜡包埋,制作切片,HE染色,光学显微镜下观察睾丸组织的病理改变情况。

1.2.8   小鼠睾丸中酶活性的测定

取小鼠左侧睾丸置于组织匀浆器中,按1:9比例加入冷生理盐水,在冰浴中尽快剪碎组织并研磨至混合均匀。将研磨好的组织匀浆于4℃、3500r/min(离心半径为10cm)离心10min,取上清液,分别用试剂盒测定睾丸组织总蛋白质含量,LDH、SDH和SOD活性(以每g蛋白计)。

1.3   统计学分析

研究结果采用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量资料采用x±s进行描述。小鼠体重、睾丸和附睾重量及脏器系数、精子数量和LDH酶活性满足方差齐性条件,多组比较采用单因素方差分析法,两两比较采用Dunnett-t检验;小鼠精子畸形率、SDH和SOD酶活性不满足方差齐性条件,多组比较采用Kruskal-Wallis H检验,两两比较采用Mann-Whitney检验。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   CdTe QDs的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱

合成和纯化后的CdTe QDs溶液紫外-可见吸收光谱最大吸收波长为520 nm,荧光光谱最大发射波长为546 nm,见图 2

图 2

CdTe QDs溶液的紫外-可见吸收光谱(A)及荧光光谱(B)

2.2   CdTe QDs的透射电子显微镜成像

由透射电子显微镜成像图可知,实验合成的CdTe QDs粒径大约为2~3 nm,粒径分布较均匀,分散性较好,见图 3

图 3

CdTe QDs的透射电子显微镜成像

2.3   小鼠的一般状况

染毒期间,对照组和各剂量组小鼠的进食情况、精神状态、皮毛色泽等一般表现均未出现明显异常,口、鼻、会阴均未发现异常分泌物。

2.4   小鼠体重、睾丸和附睾重量及脏器系数

表 1可知,染毒前和染毒3周后,对照组和各剂量组小鼠体重差异均无统计学意义(P > 0.05)。与对照组比较,高剂量组小鼠睾丸脏器系数降低(P < 0.05)。各剂量组小鼠睾丸重量、附睾重量及其脏器系数与对照组相比均无明显变化(P>0.05)。

表1

CdTe QDs染毒后各组小鼠体重、睾丸和附睾重量及脏器系数(x±sn=8)

Table1.Weights of body, testis, and epididymis, and organ coefficients of mice exposed to CdTe QDs

2.5   小鼠精子数量和精子畸形率

表 2可知,与对照组相比,各剂量组小鼠精子数量均减少,差异有统计学意义(P < 0.05);高剂量组精子数量比中剂量组、低剂量组减少,差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组和低剂量组相比,中剂量组、高剂量组小鼠精子畸形率均升高,差异有统计学意义(P < 0.008);高剂量组与中剂量组比较,其精子畸形率升高,差异具有统计学意义(P < 0.008)。

表2

CdTe QDs染毒后各组小鼠精子数量和精子畸形率(x±sn=8)

Table2.Sperm quantity and sperm abnormality rate of mice exposed to CdTe QDs

2.6   小鼠睾丸组织病理学观察结果

在光学显微镜下观察发现,对照组(图 4A)睾丸曲细精管排列规则,生精细胞排列致密而规则,发育完好,间质细胞散在或群集于睾丸间质之中,管腔内有大量精子。低剂量组(图 4B)和中剂量组(图 4C)有少数生精细胞脱落进入管腔,生精细胞排列有一定程度紊乱;中剂量组(图 4C)和高剂量组(图 4D)生发层厚度减小,曲细精管部分精母细胞和支持细胞凋亡,精子数量减少,管壁变形(如箭头所示)。

图 4

CdTe QDs染毒后各组小鼠睾丸组织病理学结果(HE染色,×200)

2.7   小鼠睾丸中酶活性测定结果

表 3可知,与对照组相比,各剂量组小鼠睾丸LDH活性和SOD活性无明显变化,差异无统计学意义(P > 0.05);SDH活性下降,差异有统计学意义(P < 0.05)。

表3

CdTe QDs染毒后各组小鼠睾丸LDH、SDH和SOD活性(x±s,U/g,n=8)

Table3.Activities of LDH, SDH, and SOD in the testis of mice exposed to CdTe QDs

3   讨论

生殖健康是人类个体健康与种群健康的重要方面。然而,人类生殖能力尤其是男性的生殖能力在不断下降。除了重金属、氮氧化物自由基、放射性物质等能够产生雄性生殖毒性外,新型纳米材料如纳米二氧化硅、纳米金、QDs等暴露后对雄性生殖系统产生的影响也引起了各界的广泛关注。衡量雄性生殖健康的重要指标是精子的数量和质量。精子数量是维持雄性生育能力的重要前提。本研究表明,CdTe QDs染毒后各剂量组精子数量均低于对照组,高剂量组精子数量低于中、低剂量组。在正常情况下,人与其他哺乳动物的精液中存在少量畸形精子,当受到某些生殖毒物的作用时,畸形精子数大大增加[11]。本研究也表明,CdTe QDs染毒后中、高剂量组精子畸形率均高于对照组和低剂量组,且高剂量组精子畸形率高于中剂量组。

精子数量的减少原因,通常被认为是由于化学物质对睾丸组织结构和各级生精细胞的生长产生了毒性作用,导致在精子形成期睾丸组织细胞结构受损而影响精子的正常发育[12]。本研究对小鼠睾丸组织病理学观察结果显示,随着CdTe QDs剂量的增加,低、中剂量组有少数生精细胞脱落进入管腔,生精细胞排列有一定程度紊乱;中、高剂量组生发层厚度减小,曲细精管部分精母细胞和支持细胞凋亡,精子数量减少,管壁变形,渗出液增多;此外,高剂量的CdTe QDs使得睾丸的重量及脏器系数下降,说明其可能导致睾丸结构破坏或发生其他退行性改变。

本研究结果还显示,与对照组相比,小鼠睾丸SDH活性下降。这可能是由于在精子形成期CdTe QDs对生长因子和酶活性产生抑制作用。SDH主要分布于生精细胞和精子线粒体膜,在精子能量代谢中起重要作用,可作为精子功能成熟和形态完善的标志酶[13]。该结果表明CdTe QDs可能抑制SDH的活性,使睾丸生精细胞的能量代谢发生障碍,影响生精微环境,使得生精过程受阻,从而影响精子生成的数量和质量。

LI等[14]用微波法合成了巯基丙酸修饰的CdTe QDs并给予小鼠染毒,其CdTe QDs的合成方法、修饰基团、染毒剂量和染毒时间与本实验设计不同,其结果发现低剂量(0.2 nmol/只和2 nmol/只)CdTe QDs染毒90 d后,未明显影响小鼠精子数量,但在小鼠睾丸中累积并损坏睾丸组织结构,且高剂量染毒组小鼠精子畸形率明显增加。该研究与本研究结果表明,CdTe QDs不同接触时间及剂量会对小鼠睾丸组织和精子质量造成不同程度的损害。

随着CdTe QDs在生物医学领域中的应用日益增多和深入,其引起的安全性问题也应得到重视。本研究结果表明,CdTe QDs对雄性小鼠睾丸组织和精子质量会造成一定程度的损伤。但因精子生成与发育过程十分复杂,受多个环节的调控,如CdTe QDs对性激素水平、DNA氧化损伤情况以及生精细胞凋亡情况的影响还需进一步探讨。

图 1

CdTe QDs纯化流程图

Figure 1 Purification process of CdTe QDs

图 2

CdTe QDs溶液的紫外-可见吸收光谱(A)及荧光光谱(B)

Figure 2 UV-visible absorption spectrum(A) and fluorescence spectrum(B) of CdTe QDs solution

图 3

CdTe QDs的透射电子显微镜成像

Figure 3 CdTe QDs under transmission electron microscope

表1

CdTe QDs染毒后各组小鼠体重、睾丸和附睾重量及脏器系数(x±sn=8)

Table 1 Weights of body, testis, and epididymis, and organ coefficients of mice exposed to CdTe QDs

表2

CdTe QDs染毒后各组小鼠精子数量和精子畸形率(x±sn=8)

Table 2 Sperm quantity and sperm abnormality rate of mice exposed to CdTe QDs

图 4

CdTe QDs染毒后各组小鼠睾丸组织病理学结果(HE染色,×200)

Figure 4 Pathological results of testis of mice exposed to CdTe QDs (HE staining, ×200)

[注]A:对照组;B:低剂量组;C:中剂量组;D:高剂量组。 [Note]A: Control group; B: Low-dose group; C: Medium-dose group; D: High-dose group.
表3

CdTe QDs染毒后各组小鼠睾丸LDH、SDH和SOD活性(x±s,U/g,n=8)

Table 3 Activities of LDH, SDH, and SOD in the testis of mice exposed to CdTe QDs

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[基金项目] 内蒙古自治区自然科学基金项目[编号:2016MS(LH)0827];内蒙古自治区高等学校科学研究项目(编号:NJZY16217);包头市科技计划项目(编号:CX2017-50);包头医学院科学研究基金项目(编号:BYJJ-QM201639)

[作者简介] 张凌燕(1986-), 女, 硕士, 讲师; 研究方向:纳米毒理学; E-mail: zhanglingyan680@139.com

[收稿日期] 2017-11-09 00:00:00.0

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