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2018, 35(4):361-365.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17645

CHIP和Hsp70在三氯化铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用


山西医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室, 山西 太原 030001

收稿日期: 2017-11-01;  发布日期: 2018-07-06

基金项目: 国家自然科学基金(编号:81001241,81472959)

通信作者: 路小婷, Email: luxiaoting@sxmu.edu.cn  

作者简介: 崔双杰(1990-), 男, 硕士生; 研究方向:金属神经毒理学; E-mail:

[目的] 探究热休克蛋白70羧基末端结合蛋白(CHIP)和热休克蛋白70(Hsp70)在三氯化铝致小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a细胞)tau蛋白异常磷酸化中的作用。

[方法] 以低、中、高剂量三氯化铝溶液(铝离子浓度分别为0.5、1.0、2.0 mmol/L)染毒N2a细胞,以不含三氯化铝溶液染毒者作为对照组,染毒48 h后显微镜下观察细胞形态,CCK-8法检测细胞活力,用Western blot法测定细胞tau-5蛋白、磷酸化蛋白(pThr181、pThr231、pSer262、pSer396)以及CHIP和Hsp70蛋白表达情况。

[结果] 随着染毒剂量增加,细胞数量逐渐减少,突触回缩,胞体变圆。中、高剂量组细胞活力百分比[(91.37±0.03)%和(78.45±0.10)%]明显低于对照组[(100.00±0.00)%](P<0.05,P<0.01)。高剂量组tau-5蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.01);中、高剂量组pThr231蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.01);各染毒组pSer396蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05或P<0.01);各组pThr181、pSer262蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。各染毒组CHIP、Hsp70表达水平均高于对照组(P<0.05或P<0.01)。

[结论] 三氯化铝可以导致N2a细胞pThr231、pSer396表达增高,其作用机制可能与CHIP和Hsp70表达变化有关。

关键词: CHIP;  Hsp70;  铝;  tau蛋白;  磷酸化 

铝是地壳中第三大化学元素,也是含量最多的金属元素,被广泛应用于日常生产、生活中。铝可经多种途径进入人体,进入机体的铝大多与转铁蛋白结合,通过血脑屏障,在脑组织中大量蓄积[1]。铝的过量蓄积可能是导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等神经退行性病变的原因之一。神经原纤维缠结(neurofibrilary tangles,NFTs)是AD典型的脑病理特征之一,对AD患者脑组织中的NFTs进行研究发现,NFTs中高度富集铝和异常磷酸化的tau蛋白,提示铝在NFTs的形成和累积过程中发挥重要作用[2]。课题组前期人群研究[3-4]、动物实验[5]、体外实验[6]均发现铝可导致tau蛋白过度磷酸化。在正常生理情况下,tau蛋白可以促进微管组装,在维持神经元的完整性和轴突运输中起重要作用[7-8]。但是在病理情况下,tau蛋白发生异常磷酸化,丧失生物学活性,导致tau蛋白从微管上解离。同时,异常磷酸化的tau蛋白易于聚积,并组装成双螺旋细丝(paired helical filam ents,PHFs),最终形成NFTs。有研究表明,在正常生理条件下细胞内可溶性tau蛋白主要由泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)降解,而当环境毒素、遗传因素及老龄化等因素抑制或下调UPS的活性及功能时,细胞内tau蛋白的降解将会发生障碍[9]。最近研究发现,热休克蛋白70羧基末端结合蛋白(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein,CHIP)是tau蛋白特异性的泛素连接酶3,介导热休克蛋白70(hot shock protein 70,Hsp70)和蛋白酶体降解系统间的连接,在培养的细胞中,可以催化tau蛋白泛素化,调节tau蛋白的降解[10-11]。既然铝可导致tau蛋白异常磷酸化,而tau蛋白是CHIP特异性的底物,那么UPS中的CHIP和Hsp70是否参与铝导致tau蛋白异常磷酸化的过程呢?

本研究以小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a细胞)为对象,采用三氯化铝染毒,观察细胞形态、活力变化,测定tau-5蛋白、4种磷酸化蛋白(pThr181、pThr231、pSer262、pSer396)、CHIP和Hsp70蛋白的表达,探讨CHIP和Hsp70在三氯化铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   N2a细胞株

购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2   主要试剂

三氯化铝(纯度为97.00%,天津市风船化学试剂科技有限公司,中国),MEM/EBSS培养基(HyClone,美国),胎牛血清(BioInd,以色列),胰蛋白酶-EDTA消化液、青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司,中国),Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所,日本),哺乳动物蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、ECL高灵敏度化学发光检测试剂盒、GADPH、HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG(北京康为世纪生物科技有限公司,中国),tau-5、pThr231、pSer262、pSer396、CHIP(Abcam,美国),pThr181、Hsp70(Gene Tex,美国)。

1.1.3   主要仪器与耗材

二氧化碳恒温培养箱(Thermo,美国);Ⅸ71型倒置荧光显微镜(Olympus,日本);SW-CJ-2F型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司,中国);低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司,中国);Modle 680酶标仪(Bio-Rad,美国);超速低温离心机(Eppendorf,德国);电泳仪(北京六一仪器厂,中国);恒温干燥箱(上海康路仪器设备有限公司,中国);凝胶成像仪Universal Hood Ⅱ (Bio-Rad,美国);96孔板、6孔板、25 cm2细胞培养瓶(Corning,美国)。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养及染毒

N2a细胞采用MEM/EBSS培养基(含体积分数为10%的胎牛血清和1%的青链霉素的混合液),置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养,每3 d传代1次。选取对数生长期的同代细胞,弃旧培养液,D-Hanks液洗涤3次,染毒组加入含三氯化铝的培养液,使Al3+终浓度分别为0.5、1.0、2.0 mmol/L(低、中、高剂量组),对照组加入不含三氯化铝的培养液,每组设3个复孔。染毒后继续培养48h,收取细胞样品进行后续实验。

1.2.2   观察细胞形态和CCK-8法检测细胞活力

取对数生长期N2a细胞,将其制成5×104个/mL的细胞悬液,混匀后接种于96孔板,每孔100 μL细胞悬液。待细胞融合至50%~60%,弃旧培养液,D-Hanks液洗涤1次,染毒(同上),同时设对照组、空白组(仅含培养液,无细胞),每组设6个重复孔,置于5%恒温培养箱培养。48 h后,显微镜下观察细胞形态,弃染毒液,D-Hanks液洗涤1次,每孔加入100 μL新的培养液,并按说明书要求每孔加入10 μL CCK-8试剂,混匀,于培养箱继续培养2 h,在酶标仪450 nm波长处测定光密度(optical density,D)值,按照以下公式计算细胞活力:细胞活力= [(D染毒组-D空白组)/(D对照组-D空白组)]×100%。

1.2.3   Western blot法检测蛋白水平

将染毒48 h后的细胞除去培养基,D-Hanks液洗涤细胞3次,用质量分数为0.25%的胰酶消化细胞,1 000 r/min(离心半径:16 cm)离心5 min,弃上清。用D-Hanks平衡盐溶液清洗2次,将细胞收集至1.5 mL离心管中。按哺乳动物蛋白抽提试剂盒说明书抽提细胞总蛋白,采用BCA蛋白定量试剂盒进行总蛋白定量,调整各蛋白样品浓度使其相同,加入相应体积的5×上样缓冲液混匀,煮沸5 min。根据不同目标蛋白的含量,取适量的总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳。电泳后湿转至聚偏二氟乙烯膜上,用质量分数为5%的脱脂牛奶TBST溶液室温封闭2 h,加入相应的一抗,4℃孵育过夜。TBST漂洗3次,每次10 min。加入相应的二抗,37℃孵育2 h。TBST漂洗3次,每次10 min。将ECL发光液均匀涂布于聚偏二氟乙烯膜上,用凝胶成像仪选择合适的曝光时间进行显影,并用Quantity One-4.6.5软件得到各组灰度值,以对照组表达量为1,计算各染毒组与对照组tau-5、pThr181、pThr231、pSer262、pSer396、CHIP和Hsp70蛋白表达量的相对值。

1.3   统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验符合正态分布,以x±s表示,不同组间比较采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   细胞形态变化

显微镜下观察各组N2a细胞形态发现,对照组细胞状态良好,大小均一,密集铺满培养瓶底;与对照组相比,低剂量组细胞数量减少,突触变短,细胞间连接减少;中剂量组细胞数量明显减少,突触进一步变短;高剂量组细胞数量明显少于前三组,且细胞变圆,突触几乎消失。见图 1

图 1

三氯化铝染毒后各组N2a细胞形态学变化

2.2   细胞活力变化

随着染毒剂量的增加,N2a细胞活力逐渐下降。对照组和低、中、高剂量组的细胞活力百分比分别为(100.00±0.00)%、(93.93±0.04)%、(91.37±0.03)%和(78.45±0.10)%,中、高剂量组细胞活力较对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

2.3   铝离子对tau蛋白及各磷酸化蛋白的影响

随着染毒剂量的增加,细胞的tau-5、pThr231、pSer396蛋白表达水平逐渐升高,而pThr181、pSer262蛋白表达水平变化不明显。与对照组相比,高剂量组tau-5蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.01);中、高剂量组pThr231蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.01);低、中和高剂量组pSer396蛋白含量表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表 1

表1

三氯化铝染毒后各N2a组细胞tau-5及各磷酸化蛋白的相对表达量(x±sn=9)

2.4   铝离子对CHIP和Hsp70蛋白表达的影响

与对照组相比,低、中和高剂量组细胞的CHIP和Hsp70蛋白含量表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表 2

表2

三氯化铝染毒后各组N2a细胞CHIP及Hsp70蛋白的相对表达量(x±sn=9)

3   讨论

铝是一种公认的慢性蓄积性神经毒物,可引起神经元纤维变性,诱导神经细胞死亡,造成神经元严重损失,继而导致神经退行性疾病。本研究结果显示,随着三氯化铝染毒剂量的增加,N2a细胞数量逐渐减少,突触变短,高剂量组细胞数量减少明显;细胞活力逐渐降低,高剂量组活力下降明显,进一步说明了铝对细胞的毒性作用。

NFTs形成是AD重要的病理特征之一,磷酸化tau蛋白为NFTs的重要组成成分[12]。LU等[4]研究发现,电解铝作业的退休工人淋巴细胞中tau-5、pThr181、pThr231含量明显高于对照人群,而贾志建等[5]通过在饲料中添加三氯化铝对小鼠进行长期铝染毒,结果发现低剂量铝可使tau-5、pThr231、pSer262、pSer396蛋白的表达明显高于对照组,但pThr181蛋白在不同剂量组之间的表达没有差异,这提示铝致tau蛋白磷酸化可能存在种属差异。KLATZO等[13]通过给新西兰大白兔注射铝盐,观察到NFTs聚集,而MIZOROKI等[14]通过小鼠腹腔注射麦芽酚铝并未观察到NFTs聚集,这说明tau蛋白异常磷酸化可能存在种属差异。那么,在不同种属来源的细胞tau蛋白磷酸化位点是否也存在差异呢?本研究选用小鼠源性的神经母细胞瘤细胞,用不同浓度三氯化铝进行染毒,结果显示高剂量组tau-5和中、高剂量组pThr231蛋白表达量明显高于对照组,并且低剂量组就可引起pSer396高表达;而pThr181、pSer262蛋白表达量在各剂量组之间的表达差异无统计学意义。王昊等[6]对SH-SY5Y细胞染铝,发现低剂量组就可使tau-5、pThr181、pThr231、pSer396蛋白表达量明显升高,pSer262蛋白表达在高剂量组明显升高。由此看来,体外实验不同细胞系的tau蛋白磷酸化位点也存在差异。

CHIP可以和Hsp70相互作用并抑制Hsp70的活性[15-16]。SHIMURA等[10]认为tau蛋白的磷酸化是tau蛋白被CHIP泛素化的信号,并且Hsp70是CHIP泛素化tau蛋白所必须的,因为Hsp70可以识别磷酸化的tau蛋白并且把其呈递给CHIP。那么,铝导致的tau蛋白异常磷酸化是否也可以被Hsp70识别并且把其呈递给CHIP呢?本研究发现,经不同浓度AlCl3染毒N2a细胞,CHIP和Hsp70蛋白的表达量均随染毒剂量的增加而升高,提示铝导致的tau蛋白磷酸化可能被Hsp70识别并把其呈递给CHIP。

综上所述,三氯化铝可以导致N2a细胞pThr231、pSer396、CHIP和Hsp70表达增高,这提示铝导致的tau蛋白异常磷酸化可能与UPS降解途径有关,但其具体机制尚不清楚,有待进一步研究。

图 1

三氯化铝染毒后各组N2a细胞形态学变化

Figure 1 [注]A:对照组;B:低剂量组(0.5mmol/L AlCl3);C:中剂量组(1.0mmol/L AlCl3);D:高剂量组(2.0mmol/L AlCl3)。箭头显示细胞变圆。
表1

三氯化铝染毒后各N2a组细胞tau-5及各磷酸化蛋白的相对表达量(x±sn=9)

Table 1
表2

三氯化铝染毒后各组N2a细胞CHIP及Hsp70蛋白的相对表达量(x±sn=9)

Table 2

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[基金项目] 国家自然科学基金(编号:81001241,81472959)

[作者简介] 崔双杰(1990-), 男, 硕士生; 研究方向:金属神经毒理学; E-mail: csjcwl@163.com

[收稿日期] 2017-11-01 00:00:00.0

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