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2018, 35(7):607-612.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17606

大气细颗粒物对SH-SY5Y细胞能量代谢的影响


1. 山西医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室, 山西 太原 030001 ;
2. 美国国立卫生研究院, 美国 马里兰州 20899

收稿日期: 2017-10-11;  发布日期: 2018-09-01

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:30872137);山西省优势和特色重点学科建设项目(编号:无)

通信作者: 郑金平, Email: zheng_jp@sxmu.edu.com  

作者简介: 班红芳(1991-), 女, 硕士生; 研究方向:神经毒理学; E-mail:

[目的] 研究大气细颗粒物(PM2.5)对人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞能量代谢的影响。

[方法] 用不同质量浓度(下称浓度)PM2.5(0、20、40、80、160、320 mg/L)染毒SH-SY5Y细胞24 h, MTT法检测细胞存活率, 丙二醛(MDA)试剂盒检测MDA的含量, XFp细胞能量代谢分析仪检测细胞线粒体呼吸功能及糖酵解功能。

[结果] PM2.5各浓度组SH-SY5Y细胞存活率均低于对照组(均P < 0.05); 80、160、320 mg/L PM2.5组细胞内MDA含量高于对照组(均P < 0.05)。PM2.5各浓度组细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率低于对照组(P < 0.05), 分别下降了13.8%、19.7%、25.1%、35.8%、45.2%和17.0%、21.9%、28.3%、39.2%、47.9%; 40、80、160、320 mg/L PM2.5组细胞有氧呼吸最大值较对照组下降了19.0%、24.2%、28.5%、40.7%(均P < 0.05)。80、160、320 mg/L PM2.5组细胞糖酵解水平和糖酵解最大值低于对照组(均P < 0.05), 分别下降了15.9%、22.1%、26.1%和16.5%、19.6%、21.5%。SH-SY5Y细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率、有氧呼吸最大值、糖酵解水平及糖酵解最大值与细胞存活率呈正相关(r在0.65~0.86之间, P < 0.01), 与MDA值呈负相关(r为-0.53~-0.86, P < 0.05或P < 0.01)。

[结论] PM2.5可引起SH-SY5Y细胞的氧化损伤, 降低细胞线粒体呼吸功能及糖酵解功能。

关键词: PM2.5 SH-SY5Y;  能量代谢;  线粒体呼吸;  糖酵解 

随着我国城市化进程的加快, 汽车尾气和工业生产排放大量的PM2.5, 严重危害人类健康。PM2.5对心血管和呼吸系统的影响已得到充分的证明[1-3], 越来越多的证据表明其对中枢神经系统具有危害性, 线粒体介导的氧化损伤可能是其主要机制[4-6]。线粒体是进行能量代谢生成腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)的重要场所, 细胞氧化损伤产生过量的活性氧会损伤线粒体功能, 导致能量代谢异常。神经细胞不仅依靠线粒体呼吸链提供能量, 还由糖酵解途径提供部分能量[7]

目前有关大气细颗粒物PM2.5是否影响神经细胞能量代谢的研究尚不多见, 故本研究拟探讨PM2.5对人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞线粒体呼吸和糖酵解功能的影响, 分析能量代谢与氧化损伤及细胞存活率的关系, 以探讨PM2.5神经细胞毒性机制。

1   材料与方法

1.1   主要试剂与仪器

SH-SY5Y细胞、MEM/F12培养基、特级胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司, 中国), 胰蛋白酶-EDTA消化液、青链霉素混合液(100×)(北京索莱宝科技有限公司, 中国), MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞丙二醛(malondialdehyde, MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所, 中国), XFp细胞能量代谢分析仪、XFp基础培养基、XFp线粒体压力测试盒、XFp糖酵解压力测试盒、XFp探针板、XFp细胞培养板(Seahorse Bioscience, 美国), TH-1000C Ⅱ智能大流量空气颗粒物采样器(武汉市天虹仪表有限责任公司, 中国), DNM-9602G酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司, 中国)。

1.2   PM2.5的采集及制备

于2014年11月-2015年1月(采暖期)在太原市某车流量较大、交通污染严重的交通干道旁设置1个采样点。采用智能大流量空气颗粒物采样器, 配合使用PM2.5切割器和玻璃纤维滤膜(200 mm×250 mm)于每日7:00-21:00(降雨、降雪和三级以上大风天除外)进行采样。采样流量为1.05m3/min, 采样器高度为1.5m(人群呼吸带高度)。采样前将滤膜放入马弗炉, 480℃烘烤2 h; 采样后将附着有PM2.5的滤膜剪为1 cm×1 cm的大小, 浸入去离子水中, 超声震荡30 min, 4次, 洗脱PM2.5; 将洗脱液经6层无菌纱布过滤, 真空冷冻干燥洗脱液后得到PM2.5絮状物, 置于-20℃避光保存备用。取适量颗粒物, 用超纯水配置成5 mg/mL母液, 超声震荡30 min, 4℃保存备用。染毒前取出母液, 超声震荡30 min, 使颗粒物充分混悬。参照张志红等[8]的PM2.5染毒剂量, 用完全培养基稀释成0、20、40、80、160、320 mg/L进行染毒。

1.3   SH-SY5Y细胞的培养

SH-SY5Y于37℃、5%的CO2培养箱培养。完全培养基由MEM/F12培养基中加入10%的特级胎牛血清和1%青链霉素混合液(100×)配置而成。25 cm2培养瓶中, 待细胞汇合度达到约80%时, 0.25%胰酶消化, 进行细胞接种染毒及传代。

1.4   细胞存活率检测

将SH-SY5Y细胞以5×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板, 每孔100μL。待细胞汇合度约60%时, 进行染毒, 每个质量浓度(下称浓度)做3个复孔。染毒24h后, 弃去染毒液, 用酶标分析仪检测细胞存活率。

1.5   MDA含量检测

将SH-SY5Y细胞以1×106个/mL的密度接种于6孔细胞培养板中, 每孔2 mL。待细胞汇合度约60%时, 进行染毒。染毒24 h后, 弃去染毒液, PBS洗1遍, 每孔加入含体积分数为1%苯甲基磺酰氟的裂解液200μL, 轻轻摇晃培养板, 待细胞全部脱落后, 转移至2 mL EP管中, 于冰上裂解40 min, 以12 000×g离心5 min, 取上清, 酶标分析仪检测MDA含量。

1.6   SH-SY5Y细胞能量代谢的检测

SH-SY5Y细胞以5×104个/孔的密度接种于XFp细胞培养板, 24 h后, 弃去培养液; 用PM2.5染毒24 h, 弃去染毒液, 换成测试专用培养基。分别进行线粒体压力测试和糖酵解压力测试, 通过XFp细胞能量代谢分析仪检测细胞耗氧率及胞外酸化率来评估线粒体呼吸功能和糖酵解功能。

1.6.1   线粒体压力测试

分别向探针板的A、B、C孔加入10μmol/L寡霉素(ATP合酶抑制剂)、5μmol/L羰基-氰-对-三氟甲氧基苯腙(线粒体电子呼吸链解偶联剂)、5 μmol/L鱼藤酮/抗霉素A(线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ抑制剂), D孔不加药, 为空白孔。校正探针板后, 在第15、35、55 min向细胞培养板分别注入探针板中的A、B、C孔中的药物进行检测。结果按每孔细胞数目标准化, 得到线粒体压力测试曲线(见图 1), 加入鱼藤酮/抗霉素A, 极大程度抑制细胞线粒体呼吸, 此时读数为非线粒体呼吸速率; 加入寡霉素之前的基础读数减去非线粒体呼吸速率, 得到基础耗氧率; 加入寡霉素后的读数减去非线粒体呼吸速率, 得到质子漏耗氧速率; 加入FCCP后的读数减去非线粒体呼吸速率, 得到有氧呼吸最大值; 有氧呼吸最大值减去基础耗氧率, 得到有氧呼吸储备值; 基础耗氧率减去质子漏耗氧速率, 得到ATP偶联的有氧呼吸速率。

图 1

PM2.5染毒后SH-SY5Y细胞线粒体压力测试曲线

1.6.2   糖酵解压力测试

分别向探针板的A、B、C孔加入100 mmol/L葡萄糖、5 μmol/L寡霉素、500 mmol/L 2-脱氧葡萄糖(葡萄糖类似物, 竞争性结合己糖激酶)。在第15、35、55 min向细胞培养板分别注入探针板中的A、B、C孔中的药物进行检测, 结果按每孔细胞数目标准化, 得到糖酵解压力测试曲线(见图 2), 加入2-脱氧葡萄糖, 极大程度抑制细胞糖酵解, 此时读数为非糖酵解酸化速率; 加入葡萄糖后用于确定饱和状态下糖酵解水平, 其读数减去非糖酵解酸化速率, 得到糖酵解水平; 加入寡霉素后的读数减去非糖酵解酸化速率, 得到糖酵解最大值; 糖酵解最大值减去糖酵解水平, 得到糖酵解储备值。

图 2

PM2.5染毒后SH-SY5Y细胞糖酵解压力测试曲线

1.7   统计学分析

所有数据均以x±s表示, 用SPSS 18.0进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析, 多重比较采用LSD-t检验。采用线性回归进行趋势检验, 相关分析采用Pearson相关。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   SH-SY5Y细胞存活率及MDA含量的变化

随着PM2.5染毒浓度的增加, SH-SY5Y细胞存活率呈下降趋势(P趋势 < 0.05), MDA含量呈上升趋势(P趋势 < 0.05)。各浓度PM2.5处理组SH-SY5Y细胞存活率均低于对照组, 差异有统计学意义(均P < 0.05); 80、160、320 mg/L PM2.5处理组的MDA含量高于对照组, 差异具有统计学意义(P < 0.05)。见表 1

表1

不同浓度PM2.5处理组SH-SY5Y细胞存活率及MDA水平(x±sn=3)

Table1.Survival rates and MDA levels of SH-SY5Y cells treated with PM2.5 at different concentrations

2.2   SH-SY5Y细胞线粒体呼吸功能

随着PM2.5染毒浓度的增加, SH-SY5Y细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率逐渐下降(P趋势 < 0.05);与对照组相比, 各浓度PM2.5处理组基础耗氧率分别下降了13.8%、19.7%、25.1%、35.8%、45.2%, ATP偶联的有氧呼吸速率分别下降了17.0%、21.9%、28.3%、39.2%、47.9%, 差异均具有统计学意义(均P < 0.05)。SH-SY5Y细胞有氧呼吸最大值随染毒浓度的增加逐渐下降(P趋势 < 0.05);与对照组相比, 40、80、160、320 mg/L PM2.5处理组有氧呼吸最大值分别下降了19.0%、24.2%、28.5%、40.7%, 差异具有统计学意义(P < 0.05)。各浓度PM2.5处理组与对照组相比, SH-SY5Y细胞质子漏耗氧速率及有氧呼吸储备值差异无统计学意义(均P > 0.05)。见表 2

表2

不同浓度PM2.5处理组SH-SY5Y细胞线粒体呼吸功能水平[x±sn=3,pmol/(min·105个)]

Table2.Mitochondrial respiration function levels of SH-SY5Y cells treated with PM2.5 at different concentrations

2.3   SH-SY5Y细胞糖酵解功能

随着PM2.5染毒浓度的增加, SH-SY5Y细胞糖酵解水平、糖酵解最大值逐渐下降(P趋势 < 0.05);与对照组相比, 80、160、320 mg/L PM2.5处理组糖酵解水平分别降低了15.9%、22.1%、26.1%, 糖酵解最大值分别下降了16.5%、19.6%、21.5%, 差异具有统计学意义(均P < 0.05)。糖酵解储备值的差异无统计学意义(均P > 0.05)。见表 3

表3

不同浓度PM2.5处理组SH-SY5Y细胞糖酵解功能水平[x±s,pH,×10-3/(min·105个),n=3]

Table3.Glycolysis levels of SH-SY5Y cells treated with PM2.5 at different concentrations

2.4   能量代谢指标与MDA及细胞存活率的相关性

SH-SY5Y细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率、有氧呼吸最大值、糖酵解水平和糖酵解最大值与MDA水平呈负相关, 与细胞存活率呈正相关(P < 0.05或P < 0.01)。有氧呼吸储备值、糖酵解储备值与MDA水平及细胞存活率相关无统计学意义(P > 0.05)。见表 4

表4

能量代谢各指标与MDA及细胞存活率的相关性(r

Table4.Correlations of energy metabolism indicators with MDA and cell survival rate

3   讨论

SH-SY5Y细胞来源于神经系统发育的神经嵴, 是一种分化程度较低的神经母细胞瘤, 其细胞形态和生理生化功能与正常神经细胞相似, 已被广泛用于神经毒性及机制的研究[9-11]

细胞基础耗氧率表示在基础情况下细胞能量的需要, 包括ATP偶联的有氧呼吸速率(用于满足细胞能量需求的线粒体产生的ATP)和质子漏耗氧速率(可以当作线粒体损伤的标志或调节线粒体ATP产生的机制)。有氧呼吸最大值表示细胞所能达到的最大呼吸速率, 有氧呼吸储备值表示细胞对增加的能量需求的应对能力, 可以看作细胞对外界环境压力的适应能力及应对潜能。本研究发现, PM2.5降低了SH-SY5Y细胞的基础耗氧率和ATP偶联的有氧呼吸速率, 但未影响质子漏耗氧速率, 说明基础耗氧率的降低主要是因ATP偶联的有氧呼吸速率降低所致, 可以认为PM2.5影响了线粒体功能但并未损伤其结构; PM2.5降低了SH-SY5Y细胞有氧呼吸最大值, 而有氧呼吸储备值未受到影响, 说明本研究浓度范围内的PM2.5并未损伤SH-SY5Y细胞应对外界环境的潜能。进一步升高PM2.5染毒浓度是否可以导致线粒体结构损伤和应对潜能下降, 还需进一步研究。

本研究发现, 当染毒浓度增加至160mg/L以上时, PM2.5致SH-SY5Y细胞线粒体呼吸功能参数基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率和有氧呼吸最大值的下降幅度减小, 320 mg/L与160 mg/L组之间差异没有统计学意义, 但趋势检验显示其呈下降趋势, 提示PM2.5对SH-SY5Y细胞线粒体呼吸功能的影响具有剂量依赖性, 但其剂量-效应关系可能呈非线性关系。在一定剂量范围内的剂量效应模型的研究, 对进一步研究其毒作用规律具有重要意义。

糖酵解可在机体缺氧的情况下快速供能。本研究发现, PM2.5也可以降低糖酵解水平、糖酵解最大值, 320 mg/L PM2.5组糖酵解水平及糖酵解最大值分别下降了26.1%和21.5%, 说明PM2.5同时影响了SH-SY5Y细胞的糖酵解功能, 但损伤程度小于基础耗氧率和有氧呼吸最大值的下降程度(分别为45.2%和40.7%), 提示PM2.5对SH-SY5Y细胞能量代谢影响以线粒体功能损伤为主。线粒体是神经细胞正常生理活动中的核心细胞器, 其在维持细胞呼吸及能量代谢的平衡中起重要作用[12], 因此PM2.5诱发细胞线粒体能量代谢的改变在PM2.5神经毒性机制中的作用及其机制还需要进一步的探讨。

细胞存活率反映活细胞的数量和代谢活力, 活性氧降解多不饱和脂肪酸生成MDA, MDA是氧化应激的标志[13]。Pearson相关分析结果显示, SH-SY5Y细胞基础耗氧率、ATP偶联的有氧呼吸速率、质子漏耗氧速率、有氧呼吸最大值、糖酵解水平及糖酵解最大值与细胞存活率呈正相关, 与MDA呈负相关, 提示PM2.5可能通过诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤, 导致细胞线粒体呼吸及糖酵解功能的损伤, 进一步导致细胞活力下降。

综上所述, 大气PM2.5可损伤SH-SY5Y线粒体呼吸和糖酵解两条主要能量代谢通路, 特别是线粒体呼吸功能的损伤, 可能与PM2.5导致的氧化损伤有关, 具体机制需要进一步探讨。

图 1

PM2.5染毒后SH-SY5Y细胞线粒体压力测试曲线

Figure 1 Curve of mitochondrial stress test of SH-SY5Y cells treated with PM2.5 at different concentrations

[注]FCCP:羰基-氰-对-三氟甲氧基苯腙。 [ Note]FCCP: carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone.
图 2

PM2.5染毒后SH-SY5Y细胞糖酵解压力测试曲线

Figure 2 Curve of glycolysis stress test of SH-SY5Y cells treated with PM2.5 at different concentrations

表1

不同浓度PM2.5处理组SH-SY5Y细胞存活率及MDA水平(x±sn=3)

Table 1 Survival rates and MDA levels of SH-SY5Y cells treated with PM2.5 at different concentrations

表2

不同浓度PM2.5处理组SH-SY5Y细胞线粒体呼吸功能水平[x±sn=3,pmol/(min·105个)]

Table 2 Mitochondrial respiration function levels of SH-SY5Y cells treated with PM2.5 at different concentrations

表3

不同浓度PM2.5处理组SH-SY5Y细胞糖酵解功能水平[x±s,pH,×10-3/(min·105个),n=3]

Table 3 Glycolysis levels of SH-SY5Y cells treated with PM2.5 at different concentrations

表4

能量代谢各指标与MDA及细胞存活率的相关性(r

Table 4 Correlations of energy metabolism indicators with MDA and cell survival rate

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:30872137);山西省优势和特色重点学科建设项目(编号:无)

[作者简介] 班红芳(1991-), 女, 硕士生; 研究方向:神经毒理学; E-mail: bhfbll2015@126.com

[收稿日期] 2017-10-11 00:00:00.0

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