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2018, 35(4):309-315.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17594

对氨基水杨酸钠对锰染毒大鼠丘脑原代小胶质细胞氧化损伤及炎症反应的影响


1a. 广西医科大学 a. 公共卫生学院卫生毒理学教研室 b. 广西高校高发疾病预防与控制研究重点实验室,广西 南宁 530021 ;
2. 南宁市第二人民医院五象医院预防保健科, 广西 南宁 530031

收稿日期: 2017-09-26;  发布日期: 2018-05-12

基金项目: 国家自然科学基金(编号:81460505,81773476)

通信作者: 姜岳明, Email: 790965788@qq.com  

作者简介: 彭东杰(1990-), 男, 硕士生; 研究方向:神经毒理学; E-mail: 罗旖旎(1991-), 女, 硕士生; 研究方向:神经毒理学; E-mail:

[目的] 探讨对氨基水杨酸钠(PAS-Na)对体外染锰大鼠丘脑原代小胶质细胞氧化损伤、炎症反应的影响。

[方法] 将提纯、鉴定后的SD大鼠丘脑小胶质细胞分别给予含不同浓度氯化锰(MnCl2)(0、200、300、400、500 μmol/L)、PAS-Na(50、150、450 μmol/L)的完全培养基(DMEM+FBS)培养24 h,采用MTT法检测细胞存活率,根据结果选择染锰的毒性剂量并选定PAS-Na的无毒剂量。随后将细胞随机分为对照组、400 μmol/L MnCl2组、400 μmol/L MnCl2+(50、150、450 μmol/L)PAS-Na组、450 μmol/L PAS-Na组,共6组。采用MTT法检测各组小胶质细胞存活率;运用DCFH-DA探针标记,荧光倒置显微镜下观察小胶质细胞内活性氧(ROS)的产生情况;ELISA法测定炎症因子白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的蛋白分泌量和荧光定量PCR法测IL-1βTNF-α mRNA表达水平。

[结果] 400、500 μmol/L MnCl2染毒组的细胞存活率为(85.83±12.53)%、(83.30±6.33)%,低于对照组(均P < 0.05),故选择400 μmol/L作为锰的染毒剂量;与对照组比较,50、150、450 μmol/L PAS-Na组的细胞存活率无明显变化(均P>0.05)。400 μmol/L MnCl2+(50、150、450 μmol/L)PAS-Na组的细胞存活率分别为(96.00±18.11)%、(106.13±18.32)%、(110.21±15.13)%,均比400 μmol/L MnCl2组高(均P < 0.05)。与对照组比较,400 μmol/L MnCl2组细胞ROS水平、IL-1βTNF-α的蛋白及mRNA表达水平均升高(均P < 0.05)。与400μmol/L MnCl2组比较,400μmol/L MnCl2+(50、150、450μmol/L)PAS-Na组的ROS水平、TNF-α分泌量和IL-1β mRNA表达量均降低(均P < 0.05),400 μmol/L MnCl2+(150、450 μmol/L)PAS-Na组的TNF-α mRNA表达量降低(均P < 0.05)。

[结论] PAS-Na可减轻锰致大鼠丘脑原代小胶质细胞氧化损伤、炎症反应的程度。

关键词: 对氨基水杨酸钠;  锰;  小胶质细胞;  氧化应激;  炎症 

锰(manganese,Mn)是一种维持机体细胞正常功能、新陈代谢的必需微量元素。但过量锰暴露可引起神经毒作用[1-2]。锰可经消化道和呼吸道等途径进入机体并选择性地蓄积在纹状体、苍白球、海马等部位,进而引发类帕金森征,出现运动功能减退、步态不稳、肌张力“齿轮样”增高等症状[3-4]。随着含锰汽油和农药的广泛使用,锰矿开采与冶炼导致环境锰负荷增大,污染地区人群体内锰蓄积加重[5-7]。目前关于锰中毒机制的观点是,锰可通过引起氨基酸类神经递质代谢异常、氧化损伤、线粒体功能障碍等[2, 8-9]导致神经系统功能性障碍。同时,锰还可引起机体产生大量的促炎症因子如白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6等,激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及核转录因子kappa B(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)等通路,从而引起神经细胞凋亡[10]。锰中毒的干预与治疗研究主要集中在药物的促排锰或抗氧化损伤作用,如依地酸钙钠、牛磺酸、维生素C、乙酰半胱氨酸等[11-12],忽视了锰所导致的炎症反应,尤其是锰致小胶质细胞的损伤。对氨基水杨酸钠(sodium p-aminosalicylic acid,PAS-Na)不但有促排锰作用,而且也是非甾体非特异性抗炎药[7, 11],其对锰致小胶质细胞损伤是否有干预作用尚未见报道。本研究旨在细胞水平上探讨PAS-Na对体外染锰致大鼠丘脑原代小胶质细胞的炎症损伤是否有干预作用,为锰中毒的治疗提供新的科学依据。

1   材料与方法

1.1   试剂与仪器

氯化锰(MnCl2· 4H2O)、胰蛋白酶粉(Sigma,美国);PAS-Na注射用粉剂(哈药集团,中国);DMEM高糖培养基(HyClone,美国);胎牛血清(浙江天杭生物科技,中国);100 U/mL青、链霉素混合液,磷酸盐缓冲液,10 μg/mL DAPI溶液(索莱宝,中国);FITC-CD11b抗体(博奥森,中国);活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒(碧云天,中国);肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒(联科生物,中国);IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒(eBioscience,美国);荧光定量PCR试剂盒(Takara,日本)。Millipore超纯水器(Millipore,德国),Multiskan GO酶标仪和371型二氧化碳(CO2)培养箱(Thermo,美国),TG16-WS台式高速离心机(湘仪,中国),TiS倒置荧光显微镜(Nikon,日本),梯度PCR仪(MyCycler,美国),快速DNA定量仪7500Fast(Applied Biosystems,美国)。

1.2   新生大鼠丘脑原代小胶质细胞的培养及提纯

取出生24 h内SPF级新生SD大鼠(广西医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK桂2014-0002)丘脑小胶质细胞,调整细胞浓度为1×106个/mL,接种至25 mL培养瓶中,置于细胞培养箱中培养,24 h半量换液,之后每3 d换液一次,待胶质细胞长满培养瓶底部、分层。轻拍、摇晃培养瓶,收集脱落细胞,并接种到培养瓶中。

1.3   细胞免疫荧光法鉴定原代小胶质细胞

将收集到的细胞接种到24孔板中培养24 h后(浓度为×105个/mL,3个平行孔),用预冷的PBS漂洗3次,每次5 min(下同);4%多聚甲醛固定,4℃,30 min;PBS漂洗;0.25%Triton X-100室温孵育10 min以破膜;PBS漂洗;加入FITC-CD11b抗体(PBS稀释,稀释比为1:50)4 ℃过夜;PBS漂洗;加入DAPI荧光染料(10μg/mL),5 min;PBS漂洗;最后在荧光显微镜下观察。每孔随机选取3个视野,对视野里的细胞进行计数,计算被FITC-CD11b染色的细胞(绿色)占DAPI染色细胞(蓝色)的比例,即为小胶质细胞的纯度。纯度达95%以上,即可进行后续实验。

1.4   小胶质细胞的给药处理

将收集的原代小胶质细胞接种于96孔板(1×104个/孔),分8个组,每组6个平行样。待培养24 h后,分别给予含0、200、300、400、500 μmol/L氯化锰(MnCl2)和含50、150、450 μmol/L PAS-Na的完全培养基,培养24 h。采用噻唑蓝法(MTT)检测细胞存活率,根据实验结果选取合适的染锰毒性剂量,并选定PAS-Na的无毒剂量。

将小胶质细胞(1×104个/孔)随机分为正常对照组(对照组)、400μmol/L MnCl2组、450μmol/L PAS-Na组、400 μmol/L MnCl2+(50、150、450 μmol/L)PAS-Na组。对照组和PAS-Na组给予完全培养基培养24 h;MnCl2组和MnCl2+PAS-Na组给予含400 μmol/L MnCl2的完全培养基,培养24 h。接着各组去掉原培养液,再给予对照组和MnCl2组加入新的完全培养基,MnCl2+PAS-Na组、PAS-Na组分别加入含50、150、450和450 μmol/L PAS-Na的完全培养基,继续培养24 h。

1.5   MTT法测定细胞存活率

小胶质细胞经过相应处理后,弃掉培养液,用PBS清洗1次,每孔加入100 μL新鲜培养液和10 μL MTT溶液(5 mg/mL),在培养箱中孵育4 h后,小心弃掉孔内的培养液,每孔加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),酶标仪震荡10 min,使结晶充分溶解,并在490 nm波长处检测各孔光密度(D)值,以对照组为100%,计算各组细胞存活率。细胞存活率= [(D处理-D空白)/(D对照-D空白)]×100%。

1.6   测定细胞ROS含量

将收集的小胶质细胞种于12孔板,×105个/孔,每组设3个平行孔。按ROS检测试剂盒说明书进行操作。用试剂盒中活性氧阳性对照物(Rosup)设立阳性对照组,其余按照分组处理细胞后,去掉原培养液,加入含10 μmol/L DCFH-DA探针(来自ROS检测试剂盒)的无血清培养液1 mL,置于培养箱孵育20 min,用无血清培养液洗3次,去掉未转载入细胞的DCFH-DA。DCFH-DA装载入细胞中与ROS反应,生成绿色荧光产物二氯荧光素,使ROS被标记,结果在荧光倒置显微镜下观察。

1.7   ELISA测定细胞上清液炎症因子含量

收集各组细胞培养基,按照ELISA试剂盒步骤测定各组炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达水平。每组设3个平行孔。

1.8   荧光定量PCR测定细胞炎症因子mRNA表达

采用荧光定量PCR技术测定TNF-αIL-1β mRNA表达。将小胶质细胞种于6孔板中,2×105个/孔。按分组处理细胞后,Trizol法提取总RNA,紫外分光光度计检测其浓度及纯度。RNA的D260/D280值在1.8~2.1,纯度较好。调整总RNA浓度至300 ng/μL,用荧光定量PCR试剂盒中的PrimeScript RT reagent,将RNA逆转录为cDNA,反应条件:37 ℃,15 min;85℃,5 s;4℃保存备用。将逆转录好的cDNA按照试剂盒中的SYBR Premix Ex Tag Ⅱ试剂说明书扩增目的基因。反应条件:预变性95℃、30 s,变性95℃、5 s,退火和延伸60℃、34 s;共40个循环。每个样本设3个复孔,实验重复3次。反应结束后以2-ΔΔCt法计算每个样本各基因mRNA的含量。IL-1βTNF-α和内参基因GAPDH的引物由日本Takara公司合成,见表 1

表1

荧光定量PCR基因引物

Table1.Target gene primers for fluorescence quantitative PCR

1.9   统计学分析

数据以x±s表示。用SPSS 17.0软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   原代小胶质细胞的纯度鉴定

图 1所示,荧光显微镜下观察,绿色荧光显示的是与FITC-CD11b抗体结合的小胶质细胞,蓝色荧光显示的是细胞核。小胶质细胞的纯度为95.23%,可用于后续实验。

图 1

原代小胶质细胞镜下观察(×200)

2.2   锰及PAS-Na的剂量选择

表 2所示,与对照组比较,400μmol/L和500μmol/L染MnCl2组细胞存活率降低(均P < 0.05),故选择400 μmol/L作为染锰的毒性剂量。PAS-Na组(50、150、450 μmol/L)与对照组比较,细胞存活率差异没有统计学意义(均P > 0.05),即PAS-Na浓度在50、150、450 μmol/L时,对小胶质细胞存活率影响不大。

表2

MnCl2和PAS-Na对大鼠小胶质细胞存活率的影响(x±sn=6,%)

Table2.Survival rates of microglia in rats exposed to MnCl2 and PAS-Na

2.3   PAS-Na对染锰小胶质细胞存活率的影响

400μmol/L MnCl2组细胞存活率低于对照组(P < 0.05)。400μmol/L MnCl2+(50、150、450μmol/L)PAS-Na组细胞存活率分别为(96.0±18.11)%、(106.13± 18.32)%、(110.21±15.13)%,均比400 μmol/L MnCl2组高(均P < 0.05),且有随着PAS-Na浓度增加呈升高趋势。450μmol/L PAS-Na组细胞存活率与对照组比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。

2.4   PAS-Na对染锰小胶质细胞ROS水平的影响

400 μmol/L MnCl2组被标记的细胞数比对照组多,即ROS水平高于对照组。与400 μmol/L MnCl2组比较,400μmol/L MnCl2+(50、150、450μmol/L)PAS-Na组被标记的细胞数减少,荧光强度减弱;450μmol/L PAS-Na组被标志的细胞数与对照组差别不大。见图 2

图 2

PAS-Na和MnCl2给药后大鼠丘脑小胶质细胞ROS检测结果(×100)

2.5   PAS-Na对染锰丘脑小胶质细胞炎症因子含量的影响

与对照组比较,400μmol/L MnCl2组细胞IL-1β、TNF-α质量浓度(以下称浓度)升高(P < 0.05),IL-6浓度未出现明显变化(P > 0.05)。与400μmol/L MnCl2组比较,400μmol/L MnCl2+(50、150、450μmol/L)PAS-Na组的TNF-α浓度降低(P < 0.05),IL-1β和IL-6未见明显改变(P > 0.05)。450 μmol/L PAS-Na组与对照组间IL-1β、IL-6和TNF-α浓度的差异没有统计学意义(P > 0.05)。结果见表 3

表3

PAS-Na对染锰大鼠丘脑小胶质细胞炎症因子的干预作用(x±sn=3,ng/L)

Table3.Intervention effects of PAS-Na on inflammatory factors of rat thalamic microglia induced by manganese

2.6   PAS-Na对染锰丘脑小胶质细胞IL-1βTNF-α mRNA表达的影响

表 4所示,与对照组比较,400 μmol/L MnCl2IL-1βTNF-α mRNA表达量均升高(P < 0.05)。与400 μmol/L MnCl2组比较,400 μmol/L MnCl2+(50、150、450 μmol/L)PAS-Na组IL-1β mRNA表达量降低(P < 0.05),400μmol/L MnCl2+(150、450μmol/L)PAS-Na组的TNF-α mRNA表达量降低(P < 0.05)。450μmol/L PAS-Na组与对照组间IL-1βTNF-α mRNA表达的差异没有统计学意义(P>0.05)。

表4

PAS-Na对染锰大鼠丘脑小胶质细胞IL-1βTNF-α mRNA表达的影响

Table4.The effect of PAS-Na on IL-1β and TNF-α mRNA expression in rat thalamic microglia induced by mangansese

3   讨论

小胶质细胞是广泛分布于中枢神经系统中的免疫细胞,具有提呈抗原、分泌细胞因子、吞噬病原和坏死组织、维持大脑稳态的作用,被称为神经系统的巨噬细胞[13-14]。小胶质细胞易被脑内微环境的变化如感染、损伤等所激活,释放可溶性细胞因子如神经营养因子,对神经元起到一定的保护作用[15]。近来研究表明,在脑内蓄积的锰可刺激小胶质细胞,引起其增殖和激活:MnCl2染毒1 d可以观察到SD大鼠大脑黑质部的小胶质细胞被激活,7 d可以观察到黑质部出现大量小胶质细胞激活及酪氨酸羟化酶阳性的神经元数量明显减少的现象[16-17]。亦有研究显示过高浓度的锰暴露可降低使胶质细胞存活率[18-19]。锰可大量蓄积在线粒体中,损伤碱基,引起DNA戊糖环断裂[20],同时产生大量ROS促进氧化应激,破坏线粒体,阻碍腺苷三磷酸生成,进而致细胞凋亡[21]。本研究结果也显示,体外染锰可使大鼠原代丘脑小胶质细胞存活率降低,ROS产生增多。

小胶质细胞主要有静息的分枝状和激活的阿米巴状,静息态分枝状小胶质细胞起到清除代谢产物和灭活细胞毒物的作用[15],当微环境发生变化时,小胶质细胞受到刺激,体积增大,转化为具有变形和吞噬功能的阿米巴状激活态。锰致小胶质细胞损伤产生的ROS和基因碎片不能及时被清除时,其可作为损伤相关分子被小胶质细胞的模式识别受体识别,从而激活小胶质细胞[22-23]。TNF-α和IL-1β是参与炎症反应的重要介质,是炎症早期的重要标志物[10, 24]。研究发现,激活的小胶质细胞有M1促炎型和M2抗炎型,M2型的特点是能够释放抗炎因子(如IL-4、IL-10、IL-13等),具有吞噬损伤细胞碎片和修复损伤的功能,通过减少炎症反应起到保护神经元和促进神经元再生的作用[25]。小胶质细胞受到二次或长时间刺激激活后转化为M1型后,可同时激活MAPKs、NF-κB等通路发生自噬作用,分泌大量促炎因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α)[26-27]。脂多糖和锰共同作用可激活小胶质细胞,使其分泌除IL-1β、TNF-α外的其他炎症因子,如IL-6、诱导型一氧化氮合酶等[28]。这些炎症因子在局部持续升高对神经细胞产生直接毒性并诱导神经细胞凋亡。本研究结果观察到,锰可致大鼠丘脑原代小胶质细胞IL-1β、TNF-α分泌及其mRNA的表达量增多,提示锰可激活小胶质细胞,诱导炎症反应。

近年来,药物调控小胶质细胞的炎症反应是研究的热点,如非瑟酮、汉防己甲素、地胆草等药物通过调控NF-κB等炎症相关信号通路活性,减少炎症介质的产生,从而缓解炎症反应引起的神经系统损伤[29-31]。PAS-Na可用于治疗结核病,也有非特异性抗炎作用。SINGH等[32]最先提出PAS具有促排锰作用。本课题组前期临床研究发现,PAS-Na对锰中毒患者的治疗效果较好,副作用少,不易复发[7, 11]。PAS-Na可使锰暴露大鼠基底核或肝组织超氧化物歧化酶和还原性谷胱甘肽活性升高,丙二醛含量降低,从而抑制锰引起的氧化损伤[2, 33]。除NF-κB途径外,MAPK途径可通过介导氧化应激,凋亡和炎症过程参与帕金森病的神经变性损伤[34-35]。此外,MAPK的激活与前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的合成增多有关[36]。而锰可通过上调COX-2的转录水平和蛋白表达来提高PGE2水平[37]。体内研究发现,PAS可以逆转锰致大鼠脑内PGE2升高,证明PAS能有效减少锰的负担,缓解神经炎症[38]。此外,本课题组还发现PAS-Na可通过调节MAPK信号通路及COX-2,抑制锰致大鼠神经炎症损伤[10]。本研究结果显示,PAS-Na可降低锰致小胶质细胞IL-1β mRNA和TNF-α mRNA的表达及TNF-α的蛋白水平。因此,推测PAS-Na对锰致丘脑小胶质细胞氧化损伤及炎症反应具有一定的干预作用。

表1

荧光定量PCR基因引物

Table 1 Target gene primers for fluorescence quantitative PCR

图 1

原代小胶质细胞镜下观察(×200)

Figure 1 Microscopic observation of primary microglia

[注]绿色为FITC-CD11b抗体染色的小胶质细胞,蓝色为DAPI染色的细胞核。 [Note]Green represents FITC-CD11b-stained microglia, and blue represents DAPI-stained nuclei.
表2

MnCl2和PAS-Na对大鼠小胶质细胞存活率的影响(x±sn=6,%)

Table 2 Survival rates of microglia in rats exposed to MnCl2 and PAS-Na

图 2

PAS-Na和MnCl2给药后大鼠丘脑小胶质细胞ROS检测结果(×100)

Figure 2 ROS production in rat thalamic microglia exposed to PAS-Na and MnCl2

[注(Note)]A:对照组(Control);B:阳性对照组(Positive control);C:450 μmol/L PAS-Na;D:400μmol/L MnCl2;E:400μmol/L MnCl2+ 50 μmol/L PAS-Na;F:400 μmol/L MnCl2+ 150μmol/L PAS-Na;G:400μmol/L MnCl2+ 450μmol/L PAS-Na。
表3

PAS-Na对染锰大鼠丘脑小胶质细胞炎症因子的干预作用(x±sn=3,ng/L)

Table 3 Intervention effects of PAS-Na on inflammatory factors of rat thalamic microglia induced by manganese

表4

PAS-Na对染锰大鼠丘脑小胶质细胞IL-1βTNF-α mRNA表达的影响

Table 4 The effect of PAS-Na on IL-1β and TNF-α mRNA expression in rat thalamic microglia induced by mangansese

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[基金项目] 国家自然科学基金(编号:81460505,81773476)

[作者简介] 彭东杰(1990-), 男, 硕士生; 研究方向:神经毒理学; E-mail: 798618079@qq.com 罗旖旎(1991-), 女, 硕士生; 研究方向:神经毒理学; E-mail: 357627582@qq.com

[收稿日期] 2017-09-26 00:00:00.0

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对氨基水杨酸钠对锰染毒大鼠丘脑原代小胶质细胞氧化损伤及炎症反应的影响

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