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2018, 35(5):400-405.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17585

芳烃受体表达在焦炉工多环芳烃暴露致DNA氧化损伤中的作用


山西医科大学公共卫生学院劳动卫生学教研室, 山西 太原 030001

收稿日期: 2017-09-25;  发布日期: 2018-06-02

基金项目: 山西省自然科学基金项目(编号:201701D121146);国家自然科学基金项目(编号:81273041)

通信作者: 杨瑾, Email: yj750410@163.com  

作者简介: 刘艳丽(1991-), 女, 硕士生; 研究方向:职业肿瘤发生机制及预防; E-mail:

[目的] 探讨芳烃受体(AhR)基因表达在焦炉工多环芳烃(PAH)暴露致DNA氧化损伤中的作用。

[方法] 选择某钢铁厂焦炉工312人为研究对象,问卷调查工人的基本信息,并采集其血液和尿液。以尿中PAH代谢物2-羟基萘(2-NAP)、2-羟基芴(2-FLU)、9-羟基菲(9-PHE)和1-羟基芘(1-OHP)作为PAH暴露的生物标志物,8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)作为DNA氧化损伤的指标,采用高效液相色谱法检测2-NAP、2-FLU、9-PHE、1-OHP和8-OHdG的水平。逆转录PCR法测定血液AhR的表达量。

[结果] 根据尿中1-OHP的水平(< P25P25~P75,>P75)将工人分为低、中、高暴露组,随着尿中1-OHP水平的升高,2-FLU和9-PHE的水平也逐渐升高。logistic回归显示,校正了性别、年龄、吸烟、饮酒、2-NAP、2-FLU和9-PHE等因素后,尿中1-OHP水平与AhR表达量、8-OHdG水平相关,OR值分别为2.08(95%CI:1.21~3.58)、2.98(95%CI:1.65~5.32),尿中1-OHP水平与AhR表达量和8-OHdG水平均呈线性剂量反应关系(P趋势 < 0.05);尿中8-OHdG水平与AhR表达量相关,OR值为2.18(95%CI:1.35~3.51),并且AhR表达与8-OHdG水平呈线性剂量反应关系(P趋势=0.001)。中介效应分析结果显示:a、b、cc'4个回归系数(分别为1.59、0.32、0.36和1.61)的检验均具有统计学意义(P < 0.05),其中cc'均有意义,说明存在中介效应和直接效应;abc'同号,则说明是部分中介效应。可以认为AhR表达在PAH致DNA氧化损伤作用中起到中介作用,且为部分中介效应。

[结论] PAH暴露、AhR表达与DNA氧化损伤之间具有线性剂量反应关系,并且PAH可能通过影响AhR表达引起DNA的氧化损伤。

关键词: 多环芳烃;  芳烃受体;  氧化损伤;  1-羟基芘;  8-羟基脱氧鸟苷 

焦炉工人在工作环境中会长期接触较高浓度的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAH)。流行病学研究表明,PAH与焦炉工人肺癌的发病率密切相关[1-2],我国已将焦炉工人肺癌列为法定的职业肿瘤。PAH进入人体,与细胞内的芳烃受体(AhR)结合,调节下游代谢酶的合成。PAH须经代谢酶生物转化后才具有生物活性。动物实验发现,用相同剂量的PAH染毒,敲除AhR的小鼠患皮肤癌的概率比正常小鼠低[3]。ANDERSSON等[4]发现AhR持续活化的小鼠患胃癌的概率增高。这些研究表明AhR在肿瘤的发生中发挥一定的作用。PAH在代谢过程中产生大量的活性氧,这些活性氧会攻击DNA分子,导致DNA氧化损伤。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)是活性氧攻击DNA的主要产物,经常作为DNA氧化损伤的生物标志[5-6]。流行病学研究表明,PAH暴露与氧化损伤之间有密切的联系[7-8]。KUANG等[9]研究发现,焦炉工人PAH暴露与8-OHdG水平具有剂量反应关系。但PAH暴露是否会通过AhR表达从而影响DNA氧化损伤目前还不清楚。本研究拟以焦炉工人为对象,以其尿中2-羟基萘(2-hydroxynaphthalene,2-NAP)、2-羟基芴(2-hydroxyfluorene,2-FLU)、9-羟基菲(9-phenanthrol,9-PHE)和1-羟基芘(1-pyrenol,1-OHP)4种代谢物水平评价PAH内暴露水平,以8-OHdG水平代表DNA氧化损伤情况,探讨焦炉工尿中PAH代谢物、AhR基因表达及DNA氧化损伤之间的关系,以期从人群流行病学角度说明AhR表达在PAH致DNA氧化损伤中的作用。

1   对象与方法

1.1   研究对象

选取某焦化厂312名焦炉工人为研究对象。要求所有对象均身体健康,近3个月无放疗及化疗史,且至少工作1年。本研究经山西医科大学医学伦理委员会的批准,工人均签署知情同意书。

1.2   主要仪器与试剂

UV-240紫外分光光度计(Eppendorf,德国),iQ5实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国),肌酐(creatinine,Cr)测试盒(南京建成科技有限公司,中国),TRIzon总RNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司,中国),PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(大连宝生物工程有限公司,中国),AhR、内参肌动蛋白(β-actin)引物(Takara,美国)。

1.3   研究方法

1.3.1   问卷调查

采用自行设计的职业工人健康情况调查表,由经过统一培训的人员调查研究对象年龄、工龄、性别、文化程度、取暖方式、吸烟情况、饮酒情况、职业史及既往病史等。平均每天吸烟至少1支,连续吸烟6个月以上者定义为吸烟者;每周至少饮酒3次,连续饮酒1年以上者定义为饮酒者。

1.3.2   尿样采集与检测

用50 mL离心管收集工人20 mL晨尿,冻存管分装后放于-80℃冻存备用。采用高效液相色谱-荧光检测法分别测定尿中2-NAP、2-FLU、9-PHE、1-OHP的水平(μg/mmol,以Cr计),具体操作参见文献[10]。采用高效液相色谱-电化学检测法测定尿中8-OHdG的水平(mmol/mol,以Cr计),具体操作参见文献[11]。4种代谢物的检测限(limit of detection,LOD)为0.04~0.12 mg/L,8-OHdG的LOD为7.0 nmol/L,低于LOD的用LOD/ $\sqrt 2 $表示,结果均用尿Cr校正。

1.3.3   AhR表达的测定

抽取5 mL空腹静脉血,用肝素钠抗凝,-80℃冻存。用TRIzon总RNA提取试剂盒从全血中提取RNA,紫外可见分光光度计测其浓度和纯度。以500 ng定量计算样品所需体积,加入2 μL 5× Prime Script RT Master Mix,用无RNase水配成10μL体系,以上操作均在冰上进行。逆转录条件:37℃ 15min,85℃ 5 s,4℃,反应结束后-20℃保存备用。

取逆转录后的cDNA 2μL,加入正、反向引物各1μL,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL,用灭菌蒸馏水配成20μL体系,进行荧光定量PCR反应。引物序列由TaKaRa公司合成。β-actin正向引物:5´ GCG AGA AGA TGA CCC AGA TCA 3´;反向引物:5´ GAT AGC ACA GCC TGG ATA GCA A 3´,76 bp。AhR正向引物:5´ CCC TTG GAA ATT CAT TGC CA 3´;反向引物:5´ GGA GAG GTG CTT CAT ATG TCG TC 3´,76bp。PCR程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,循环40次;95℃ 1 min,65℃ 30 s,95℃;37℃ 10 s。每个样品重复3次,结果取其均值。

1.4   统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计分析。研究对象基本情况描述用Mn表示,连续变量组间比较用KruskalWallis H检验,分类变量用卡方检验;尿中2-NAP、2-FLU和9-PHE的水平经对数转换后仍不服从正态分布,故以MP25P75)表示。多元logistic回归分析PAH暴露、AhR表达和8-OHdG水平之间的联系。尿中PAH代谢物按P25P75分为低、中、高暴露组,AhR表达量以P25为界分为低表达组和高表达组,8-OHdG水平按P75为界分为低水平组和高水平组。模型1是校正了性别、年龄、吸烟和饮酒后进行的logistic回归,模型2指在模型1的基础上,又校正了尿中其他3种代谢物后进行的回归分析。检验水准α=0.05。

采用中介效应分析AhR表达在1-OHP与8-OHdG关系中的作用。中介效应主要是用3个线性回归方程分析自变量(1-OHP)、中介变量(AhR表达)和应变量(8-OHdG)之间的联系,其他变量(性别、年龄、吸烟、饮酒、2-NAP、2-FLU和9-PHE)作为混杂因素纳入方程,见图 1。方程1分析自变量(1-OHP)与应变量(8-OHdG)的关系,系数c为自变量对应变量的总效应;方程2分析自变量(1-OHP)与中介变量(AhR表达)的关系,系数a为自变量对中介变量的效应;方程3加入中介变量(AhR表达)后,分析自变量(1-OHP)与应变量(8-OHdG)的关系,系数b是在控制了自变量的影响后,中介变量对应变量的效应,系数c’是在控制了中介变量的影响后,自变量对应变量的直接效应。最后,通过判断回归系数cabc’是否有统计学意义来判断中介效应。其中c有意义(即自变量影响应变量)是中介效应的前提,若c有意义,则按中介效应立论。然后依次检验系数ab,若ab都有意义,说明有中介效应,检验系数c’。若c’无意义,说明直接效应无意义,只有中介效应;若c’有意义,说明直接效应也有意义,需要比较abc’是否同号。abc’异号,按遮掩效应解释结果;abc’同号,则说明是部分中介效应。详细说明参见文献[12]。

图 1

中介效应分析流程

2   结果

2.1   研究对象的基本情况

尿中1-OHP的水平(μg/mmol)按P25P75(< 0.03、0.03~0.09、>0.09)分为低、中、高暴露组(78人、157人、77人)。不同1-OHP水平组焦炉工人年龄、工龄、性别、吸烟饮酒情况、文化程度、取暖情况、8-OHdG水平和AhR表达量差异无统计学意义(P > 0.05),在2-NAP、2-FLU和9-PHE水平差异有统计学意义(P < 0.05),随着尿中1-OHP水平的升高,2-FLU和9-PHE的水平呈现逐渐增加的趋势。见表 1

表1

按尿1-OHP暴露水平分层后研究对象的基本情况[MP25P75)或n(%)]

Table1.Characteristics of participants stratified by urinary 1-OHP levels[M(P25, P75)or n(%)]

2.2   尿中PAH代谢物与AhR表达及8-OHdG的关系

分别以8-OHdG [按P75(504.88 mmol/mol)为界分为高水平组和低水平组]、AhR表达[按P25(0.38)为界分为高表达组和低表达组]作为应变量,以性别、年龄、吸烟、饮酒、2-NAP、2-FLU、9-PHE和1-OHP水平为自变量,进行logistic回归分析。结果显示:校正了混杂因素后(模型1),未观察到尿中2-NAP、2-FLU和9-PHE与AhR表达及8-OHdG的关系;进一步校正尿中其他3种代谢物后(模型2),只有尿中1-OHP的水平与AhR表达量、8-OHdG水平密切相关(P < 0.05),OR值分别为2.08(95%CI:1.21~3.58)、2.98(95%CI:1.65~5.32),随着尿1-OHP水平的增高,工人的AhR表达量(P 趋势=0.046)和尿8-OHdG浓度(P 趋势=0.001)均增高。见表 2

表2

尿1-OHP水平与AhR表达及8-OHdG水平的关系(OR及95%CI

Table2.Association of urinary 1-OHP level with AhR expression and 8-OHdG concentration(OR and 95%CI)

2.3   AhR表达与8-OHdG的关系

以8-OHdG [按P75(504.88 mmol/mol)为界分为高水平组和低水平组]作为应变量,以性别、年龄、吸烟、饮酒为自变量,进行logistic回归分析。结果显示,校正了混杂因素后,尿中8-OHdG的水平与AhR表达量密切相关(P < 0.05),OR值为2.18(95%CI:1.35~3.51)。将AhR表达量按不同水平分层后,结果见表 3。随着AhR表达量的增高,工人8-OHdG水平增高(P趋势=0.001)。

表3

AhR表达量与8-OHdG水平的关系(OR及95%CI

Table3.Association between AhR expression and high 8-OHdG level

2.4   AhR表达在PAH致DNA氧化损伤中的中介效应

以对数转换后的8-OHdG为应变量,对数转换后的AhR表达为中介变量,1-OHP为自变量,性别、年龄、是否吸烟、是否饮酒为协变量,进行中介效应检验。结果显示,4个回归系数检验均具有统计学意义(P < 0.05),其中:cc’均有意义,说明存在中介效应和直接效应;abc’同号,则说明是部分中介效应。可以认为AhR表达在PAH致DNA氧化损伤作用中起到中介作用,且为部分中介效应。见表 4

表4

AhR表达在PAH致DNA氧化损伤中的中介作用

Table4.Mediation effects of AhR expression on oxidative DNA damage induced by PAH exposure

3   讨论

本研究结果表明,焦炉工人PAH暴露与AhR基因表达和DNA氧化损伤有密切的联系,AhR基因表达与DNA氧化损伤有密切的联系,且PAH暴露、AhR表达与DNA氧化损伤存在剂量反应关系。焦炉工人PAH暴露导致的DNA损伤有部分是由AhR基因表达介导的。

焦炉工人在工作时会接触较高浓度的PAH,虽然工作环境中监测的PAHs浓度能一定程度代表工人的职业暴露水平,但考虑到个体饮食习惯、吸烟饮酒等生活因素、基因易感性以及个体吸收代谢等方面的差异,PAH的内暴露水平更能全面地代表个体PAH的接触情况。尿中羟基代谢物可有效地反映近期PAH接触情况,且尿液易于采集,故将尿中羟基代谢物作为PAH的内暴露指标。为了全面反映PAH羟基代谢物的水平,本研究选择尿中2-NAP、2-FLU、9-PHE和1-OHP作为PAH内暴露指标。本研究中4种代谢物的水平均低于邓思芸等[13]研究中的焦炉工尿中PAH代谢物水平,可能是由于焦化厂设备技术、检测方法以及地区的差异所致。本研究中AhR表达和8-OHdG的多重回归分析表明,1-OHP与AhR表达和8-OHdG水平高度关联,这说明焦炉工尿中1-OHP确实可以作为PAH内暴露的稳定标志物,与TALASKA等[14]和DUAN等[15]结果一致。

流行病学研究表明,职业PAH暴露人群尿中8-OHdG水平高于一般人群[16]。本研究中AhR表达量、8-OHdG与尿中1-OHP水平密切相关,且1-OHP与AhR表达、8-OHdG具有线性关系。该结果与彭洁等[17]、KUANG等[9]的研究一致。AhR表达与8-OHdG回归结果表明,尿中8-OHdG水平与AhR表达量密切相关,且AhR表达与8-OHdG水平具有线性关系。说明PAH暴露能导致AhR表达量增加,DNA氧化损伤加重,且PAH暴露水平、AhR表达量、DNA氧化损伤水平三者间具有一定的线性关系。

AhR的激活在颗粒物暴露诱导的氧化损伤中发挥重要的作用[18]。动物实验发现,小鼠吸入富含PAH的空气后,会诱导AhR基因表达和氧化损伤相关基因的表达[19]。细胞实验表明,在前列腺癌细胞中敲除AhR序列后,细胞氧化损伤程度减弱,使用AhR激动剂后,氧化损伤程度加剧[20]。这些研究表明PAH暴露后会导致AhR表达量的增加,DNA氧化损伤程度加重。本研究用中介效应分析结果显示,AhR表达是PAH暴露与DNA氧化损伤的中间变量,提示AhR的表达参与了PAH导致的DNA氧化损伤。从人群角度证实AhR在PAH诱导的DNA氧化损伤中发挥了中介作用。

综上所述,PAH暴露与AhR表达、DNA氧化损伤水平密切相关,且三者间具有一定的线性关系。PAH暴露与DNA氧化损伤的关系部分是由AhR表达来介导的。

图 1

中介效应分析流程

Figure 1 Flow of mediation effect analysis

表1

按尿1-OHP暴露水平分层后研究对象的基本情况[MP25P75)或n(%)]

Table 1 Characteristics of participants stratified by urinary 1-OHP levels[M(P25, P75)or n(%)]

表2

尿1-OHP水平与AhR表达及8-OHdG水平的关系(OR及95%CI

Table 2 Association of urinary 1-OHP level with AhR expression and 8-OHdG concentration(OR and 95%CI)

表3

AhR表达量与8-OHdG水平的关系(OR及95%CI

Table 3 Association between AhR expression and high 8-OHdG level

表4

AhR表达在PAH致DNA氧化损伤中的中介作用

Table 4 Mediation effects of AhR expression on oxidative DNA damage induced by PAH exposure

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[基金项目] 山西省自然科学基金项目(编号:201701D121146);国家自然科学基金项目(编号:81273041)

[作者简介] 刘艳丽(1991-), 女, 硕士生; 研究方向:职业肿瘤发生机制及预防; E-mail: yanliliu0102@163.com

[收稿日期] 2017-09-25 00:00:00.0

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