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2018, 35(2):95-101.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17550

铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响


1a. 甘肃省武威肿瘤医院科教科, 甘肃 武威 733000 ;
1b. 甘肃省武威肿瘤医院公共卫生科, 甘肃 武威 733000 ;
2. 中国科学院近代物理研究所辐射医学研究室, 甘肃 兰州 730000 ;
3. 兰州城市供水(集团)有限公司科技创新办公室, 甘肃 兰州 730000

收稿日期: 2017-09-01;  录用日期:2017-01-14;  发布日期: 2018-05-21

基金项目: 国家自然科学基金青年科学基金项目(编号:11605255);兰州市科技计划项目(编号:2015-3-75)

通信作者: 张红, Email: zhangh@impcas.ac.cn  

作者简介: 张红(1959-), 女, 博士, 研究员; 研究方向:细胞生物学; E-mail:

[目的] 研究铅和萘单独及联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响。

[方法] 将500个斑马鱼胚胎随机分为10组,以铅(0、12、48 μmol/L)和萘(0、5、20 μmol/L)单独及联合(12 μmol/L铅+5 μmol/L萘、12 μmol/L铅+20 μmol/L萘、48 μmol/L铅+5 μmol/L萘、48 μmol/L铅+20 μmol/L萘)对斑马鱼胚胎进行染毒,染毒时间为受精后8 h至受精后144 h。观察、记录并统计胚胎的死亡率、孵化率和畸形率,通过EthoVision XT软件来获取并分析斑马鱼胚胎和幼鱼的行为,包括自主抽动、心率以及幼鱼应对光周期刺激的游动速度。

[结果] 与对照组相比,48 μmol/L铅暴露组和20 μmol/L萘暴露组的死亡率明显升高(P < 0.05),孵化率明显下降(P < 0.05),20 μmol/L萘暴露组的畸形率明显升高(P < 0.05)。与同浓度的铅和萘单独暴露组相比,12 μmol/L铅+5 μmol/L萘联合暴露组和48 μmol/L铅+20 μmol/L萘联合暴露组的死亡率明显升高(P < 0.05),48 μmol/L铅+20 μmol/L萘联合暴露组的孵化率明显下降(P < 0.05),12 μmol/L铅+20 μmol/L萘、48 μmol/L铅+5 μmol/L萘、48 μmol/L铅+20 μmol/L萘联合暴露组的畸形率均明显升高(P < 0.05)。铅和萘联合暴露对胚胎的死亡率(F=2.863,P < 0.05)、孵化率(F=4.474,P < 0.05)和畸形率(F=5.084,P < 0.05)的影响存在交互作用。与空白对照组相比,48 μmol/L铅暴露组幼鱼的游动速度在第一黑暗期和第二、三明亮期明显下降(P < 0.05);与丙酮对照组相比,20 μmol/L萘暴露组幼鱼的游动速度在每一时期都明显下降(P < 0.05)。与同浓度的铅和萘单独暴露组相比,48 μmol/L铅+20 μmol/L萘联合暴露组幼鱼的游动速度在第一黑暗期明显下降(P < 0.05),铅和萘联合暴露对幼鱼游动速度的影响存在交互作用(F=4.493,P < 0.05)。

[结论] 铅和萘均可影响斑马鱼胚胎的发育,并且具有一定的神经发育毒性,而二者联合暴露对斑马鱼胚胎死亡率、孵化率、畸形率和斑马鱼幼鱼神经行为的影响有明显的交互作用。

关键词: 铅;  萘;  联合暴露;  斑马鱼胚胎;  发育毒性 

铅(Pb)是一种普遍存在于环境中的重金属污染物,其暴露会对神经系统、心血管系统、生殖系统、免疫系统以及肾脏等多个机体内系统和器官造成损伤[1-2],而且可引起明显的胚胎神经发育毒性,造成出生后的行为发育障碍[3]。大量含铅的污染物进入水环境中会破坏水域生态系统,严重影响水生生物的健康和生存[4]。多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)也是一类广泛分布于环境中的化学污染物,在环境中长期残留且不易分解,对生物具有致癌、致畸、致突变的"三致"效应,因此对人类健康以及生态环境都具有极大的危害性。美国环境保护署已经将其列入环境优先控制污染物,我国也将其列为优先控制的有毒有机污染物。萘(naphthalene,nap,C10H8)是结构最简单的PAHs,在工业中可以用来制造杀虫剂等,水体中的萘主要来源于生活污水、工业废弃物、大气沉降等,对水生生物的生长、发育和繁殖具有很大的危害性[5]。萘可以引起机体的氧化损伤,对肝脏及肌肉等组织和器官也都具有损伤作用[6]。铅和萘都是常见的水体污染物,在我国黄河兰州段的水源中均有检出。黄河兰州段位于黄河上游,周围工矿企业众多,工业废水是该水域的主要污染来源。在检测的所有重金属类污染物中,铅的含量最高,而多环芳烃类化合物是黄河兰州段主要的有机污染物,其中萘的含量也最高[7-9]。长期的铅和萘暴露可对人类和动物造成不同程度的损伤,尤其是神经系统方面[10-11]。多数文献报道集中于铅和萘单独暴露或其分别与其他毒物的联合作用,而关于两者联合暴露的毒性鲜有报道。

斑马鱼作为一种水生模式生物已被广泛应用于药物毒理学、生态毒理学、环境监测以及疾病研究等科研领域[4]。它具有多种生物学优势,包括繁殖周期短、繁殖率高、体型小、易于实验室饲养,而且体外繁殖,胚胎通体透明,使得研究人员可以在显微镜下观察整个胚胎发育的过程[12]。不仅如此,斑马鱼还可以通过渗透作用获取氧气和营养,即使在心血管有严重畸形的情况下也可以继续存活并发育较长时间,因此是环境毒理学研究的理想模式生物之一。运用斑马鱼检验环境污染物的毒理学效应,具有成本低、灵敏度高、重复性好、易操作且可检测多项毒性指标的优点[1]。其胚胎早期发育阶段对环境污染物较为敏感,以此为动物模型也开展了很多重金属及多环芳烃类有机物的毒理学研究[12-16]。本研究以原肠期的斑马鱼胚胎为实验对象,研究不同浓度的铅和萘单独及联合暴露对斑马鱼胚胎致畸效应及对其发育后期行为的影响,以探讨铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎发育的毒性作用。

1   材料与方法

1.1   主要仪器和试剂

SMZ-161体视显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司,中国),斑马鱼幼鱼行为轨迹跟踪系统(DanioVision@)、动物运动轨迹跟踪系统(EthoVision@)(诺达思信息技术公司,荷兰),醋酸铅[Pb(CH3CO2)2· 3H2O,分析纯,Sigma,美国],萘、丙酮(分析纯,国药集团化学试剂有限公司,中国),间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222,也称鱼安定;分析纯,Sigma,美国)。

1.2   实验鱼及胚胎

野生型AB品系的斑马鱼由国家斑马鱼模式动物北方中心惠赠,由中科院近代物理研究所辐射医学研究室斑马鱼模式动物实验室进行繁育。取健康且性成熟的斑马鱼,于饲养系统关灯前按雌雄1: 1的比例移入孵化器中,并用隔板将其隔开,次日光照1 h后拔出隔板,使其完成交配和产卵,收集受精卵后用标准的斑马鱼E3培养液(5 mmol/L NaCl,0.33 mmol/L CaCl2,0.33 mmol/L MgSO4· 7H2O,0.17 mmol/L KCl)冲洗并置于28.5℃的恒温光照培养箱中继续培养。胚胎发育到受精后6 h(6 hours post fertilization,6 hpf)时,在显微镜下观察胚胎发育状况,挑选发育正常的胚胎用于后续实验。

1.3   铅和萘暴露

结合本实验室前期对铅和萘单独暴露的研究结果,分别选择对斑马鱼死亡率和畸形率无明显影响和有明显影响的浓度作为单独暴露的浓度,按3×3析因设计,将实验分为10组,每组50个胚胎,各实验组的暴露浓度见表 1。使用E3培养液溶解醋酸铅[Pb(CH3CO2) 2· 3H2O],配制成480 mmol/L含铅E3母液,室温保存,实验时用E3培养液稀释到受试浓度(12 μmol/L和48 μmol/L)。萘为分析纯,先用丙酮配制成浓度为200 mmol/L的萘-丙酮母液,室温避光保存,实验时用E3培养液稀释到受试浓度(5 μmol/L和20 μmol/L),受试液中丙酮的体积分数小于0.01%。斑马鱼胚胎发育到8 hpf时进行静态染毒直至胚胎发育到144 hpf。将胚胎置于直径为10 cm的培养皿中,每皿50个并加入20 mL受试液,每实验组设3个平行。然后将培养皿置于28.5℃的恒温光照培养箱中,光周期为明14 h:暗10 h,各组均每天更换受试液。

表1

铅和萘的浓度

Table1.Exposure doses of lead and naphthalene

1.4   胚胎死亡率、孵化率和畸形率的观察

于不同的发育时间点(24、48、72 hpf)用显微镜观察斑马鱼胚胎的发育变化,并及时挑除死亡的胚胎,胚胎是否存活根据其是否存在心脏收缩来判断。最终于72 hpf统计各实验组胚胎的死亡率、孵化率和畸形率,并对存在发育畸形的幼鱼进行成像。

1.5   行为检测

随机挑取各组发育至24 hpf斑马鱼胚胎10个,用SMZ-161体视显微镜和Media Cruiser软件(Canopus Corporation,Kobe,Japan)记录斑马鱼胚胎自主抽动的情况,每次2 min并用EthoVision XT 10.0软件(Noldus Information Technology,荷兰)对数据进行分析。

当胚胎发育到48 hpf时,对其心率进行检测。用MS-222对斑马鱼胚胎进行麻醉后,立即用体视显微镜和Media Cruiser软件来记录1min内斑马鱼胚胎的心跳次数,最后用EthoVision Heartbeat Detector软件(Noldus Information Technology,荷兰)对数据进行分析。

斑马鱼幼鱼行为分析通过高通量的斑马鱼幼鱼行为轨迹跟踪系统(DanioVision@)以及动物运动轨迹跟踪系统(EthoVision XT@)来进行记录和分析。每组取8条发育到144 hpf的幼鱼置于96孔板中进行光刺激反应测试。在明场反应测试中,幼鱼在明场条件下适应20 min后记录其5 min的行为轨迹;在光周期刺激反应测试中,先让幼鱼在明场条件下适应20 min,然后开始记录其行为轨迹,设置光周期为明5 min:暗5 min,重复3次,斑马鱼幼鱼的活力状态以幼鱼的游动速度(mm/s)表示。

1.6   统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析,计数资料用x±s表示。采用单因素方差分析、LSD检验进行组间均数的比较。采用两因素析因设计资料的方差分析判断是否存在交互作用,检验水准α=0.05。作图采用Origin 7.5软件。

2   结果

2.1   铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎死亡率和孵化率的影响

图 1所示,铅和萘单独暴露组斑马鱼胚胎的死亡率呈现随着暴露浓度的增加逐渐升高,孵化率随着暴露浓度的增加逐渐降低的趋势。

图 1

铅和萘联合暴露对斑马鱼死亡率(A)和孵化率(B)的影响

Figure1.Effects of combined exposure to lead and naphthalene on mortality rate(A)and hatching rate(B)of zebrafish embryos

[注]CK:空白对照;Ace:丙酮对照;Pb:铅;Nap:萘。a:与空白对照组比较,P<0.05;b:与丙酮对照组比较,P<0.05;c:与同剂量的铅暴露组比较,P<0.05;d:与同剂量的萘暴露组比较,P<0.05。 [Note]CK: Blank control; Ace: Acetone control; Pb: Lead; Nap: Naphthalene. a: Compared to the blank control group, P < 0.05; b: Compared to the acetone control group, P < 0.05; c: Compared to the lead exposure group at the same dose, P < 0.05; d: Compared to the naphthalene exposure group at same dose, P < 0.05.

与空白对照组(4.00%)相比,单独暴露组Pb-48组(12.67%)的死亡率升高(P<0.05)。与丙酮对照组(2.67%)相比,Nap-20组(18.67%)的死亡率升高(P<0.05)。与Pb-12组(5.33%)和Nap-5组(3.33%)相比,Pb-12+Nap-5联合暴露组(12.00%)胚胎的死亡率升高(P<0.05);与Pb-48组(12.67%)和Nap-20组(18.67%)相比,Pb-48+Nap-20联合暴露组(32.67%)胚胎的死亡率升高(P<0.05)。

与空白对照组(92.00%)相比,单独暴露组Pb-48组(82.67%)的孵化率下降(P<0.05)。与丙酮对照组(94.00%)相比,Nap-20组(72.00%)的孵化率下降(P<0.05)。与Pb-48组(82.67%)和Nap-20组(72.00%)相比,Pb-48+Nap-20联合暴露组(45.33%)胚胎的孵化率下降(P<0.05)。铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎死亡率(F=2.863,P<0.05)和孵化率(F=4.474,P<0.05)的影响存在交互作用。

2.2   铅和萘联合暴露对斑马鱼幼鱼畸形率的影响

通过对斑马鱼胚胎进行形态学观察发现,低浓度的铅和萘单独暴露对斑马鱼胚胎发育期间形态无影响,高浓度的铅和萘单独暴露组以及联合暴露组的斑马鱼胚胎出现多种发育畸形,包括脊柱弯曲、尾部弯曲、心包囊水肿、卵黄囊水肿和尾部缺失(图 2A)。与丙酮对照组(0.67%)相比,Nap-20组的畸形率(20.42%)升高(P<0.05)。与Pb-12组(1.42%)和Nap-20组(20.42%)相比,Pb-12+Nap-20联合暴露组(31.35%)胚胎的畸形率明显升高(P<0.05);与Pb-48组(5.38%)和Nap-5组(0.71%)相比,Pb-48+Nap-5联合暴露组(18.06%)胚胎的畸形率明显升高(P<0.05);与Pb-48组和Nap-20组相比,Pb-48+Nap-20联合暴露组(50.72%)胚胎的畸形率也明显升高(图 2B)。铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎畸形率的影响存在交互作用(F=5.084,P<0.05)。

图 2

铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎发育畸形的影响

Figure2.Effects of combined exposure to lead and naphthalene on developmental malformation of zebrafish embryos

[注]A.铅和萘暴露引起的斑马鱼畸形。1:正常斑马鱼;2~6:畸形斑马鱼;SF:脊柱弯曲;TF:尾部弯曲;PE:心包囊水肿;YE:卵黄囊水肿;TD:尾部缺失。B.铅和萘暴露引起斑马鱼畸形率的变化。CK:空白对照;Ace:丙酮对照;Pb:铅;Nap:萘。a:与空白对照组比较,P<0.05;b:与丙酮对照组比较,P<0.05;c:与同剂量的铅暴露组比较,P<0.05;d:与同剂量的萘暴露组比较,P<0.05。 [Note] A.Malformation of zebrafish embryos exposed to lead and naphthalene. 1: Normal zebrafish; 2-6: Abnormal zebrafish; SF: Spinal flection; TF: Tail flection; PE: Pericardial edema; YE: Yolk edema; TD: Tail deficiency. B.Changes of malformation rate for zebrafish embryos exposed to lead and naphthalene. CK: Blank control; Ace: Acetone control; Pb: Lead; Nap: Naphthalene. a: Compared to the blank control group, P < 0.05; b: Compared to the acetone control group, P < 0.05; c: Compared to the lead exposure group at the same dose, P < 0.05; d: Compared to the naphthalene exposure group at same dose, P < 0.05.

2.3   铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎自主抽动和心率的影响

图 3A所示,与丙酮对照组(10.48次/min)相比,Nap-20组的自主抽动(8.23次/min)下降(P<0.05)。联合暴露组中仅有Pb-12+Nap-20组(8.05次/min)与单独暴露组Pb-12组(10.2次/min)相比自主抽动下降(P<0.05)。铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎自主抽动的影响无交互作用(F=0.430,P>0.05)。

图 3

铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎自主抽动(A)和心率(B)的影响

Figure3.Effects of combined exposure to lead and naphthalene on spontaneous movemen(t A)and heart rate(B)of zebrafish embryos

[注]CK:空白对照;Ace:丙酮对照;Pb:铅;Nap:萘。a:与空白对照组比较,P<0.05;b:与丙酮对照组比较,P<0.05;c:与同剂量的铅暴露组比较,P<0.05;d:与同剂量的萘暴露组比较,P<0.05。 [Note]CK: Blank control; Ace: Acetone control; Pb: Lead; Nap: Naphthalene. a: Compared to the blank control group, P < 0.05; b: Compared to the acetone control group, P < 0.05; c: Compared to the lead exposure group at the same dose, P < 0.05; d: Compared to the naphthalene exposure group at same dose, P < 0.05.

图 3B所示,空白对照组和丙酮对照组相比,各单独暴露组和联合暴露组斑马鱼胚胎的心率差异均无统计学意义,而且,各联合暴露组胚胎的心率与铅单独暴露组和萘单独暴露组相比差异也无统计学意义。铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎心率无交互作用(F=0.275,P>0.05)。

2.4   铅和萘联合暴露对斑马鱼幼鱼活力的影响

图 4所示,在30 min检测时间内,144 hpf的幼鱼活力随光周期(明5 min/暗5 min)变化而变化,对光刺激(由明转暗和由暗转明)均十分敏感,分别表现出游动速度的明显上升和下降。与空白对照组相比,48 μmol/L铅暴露组幼鱼的游动速度在第一黑暗期和第二、三明亮期明显下降(P<0.05);与丙酮对照组相比,20 μmol/L萘暴露组幼鱼的游动速度在每一时期都明显下降(P<0.05)。与空白对照组和丙酮对照组相比,除了Pb-12+Nap-5组幼鱼在第一明亮期,Pb-12+Nap-5、Pb-12+Nap-20和Pb-48+Nap-5组幼鱼在第三黑暗期游动速度无明显变化外,其他联合暴露组幼鱼的游动速度均明显下降(P<0.05)。在第一个黑暗期,与Pb-48组(1.24 mm/s)和Nap-20组(1.08 mm/s)相比,Pb-48+Nap-20联合暴露组幼鱼的游动速度(0.86mm/s)下降(P<0.05)。而且,在第一个黑暗期,铅和萘联合暴露对斑马鱼游动速度的影响存在交互作用(F=4.493,P<0.05);而其他两个黑暗期二者无明显交互作用。

图 4

铅和萘联合暴露对斑马鱼幼鱼游动速度随光周期变化的影响

Figure4.Effects of combined exposure to lead and naphthalene on swimming speed of zebrafish larvae after a light-to-dark photostimulation

[注]CK:空白对照;Ace:丙酮对照;Pb:铅;Nap:萘。a:与空白对照组比较,P<0.05;b:与丙酮对照组比较,P<0.05;c:与同剂量的铅暴露组比较,P<0.05;d:与同剂量的萘暴露组比较,P<0.05。 [Note]CK: Blank control; Ace: Acetone control; Pb: Lead; Nap: Naphthalene. a: Compared to the blank control group, P < 0.05; b: Compared to the acetone control group, P < 0.05; c: Compared to the lead exposure group at the same dose, P < 0.05; d: Compared to the naphthalene exposure group at the same dose, P < 0.05.

3   讨论

研究表明铅和萘暴露对斑马鱼胚胎发育具有一定的影响,造成发育畸形、氧化损伤、神经发育毒性等。目前,铅和萘的毒性研究主要集中在单一暴露。张小晶等[3]发现,铅暴露对斑马鱼胚胎具有明显的发育毒性,可以造成死亡率升高、孵化率下降、发育迟缓、细胞结构受损。豆长明等[1]发现,铅胁迫可以影响斑马鱼抗氧化系统的酶活性。DOU等[17]发现,铅暴露可以引起明显的神经发育毒性,表现为幼鱼行动迟缓,神经元和神经胶质细胞中的凋亡增加且神经细胞数量减少。另外,ALVES等[15]和SOGBANMU等[16]都发现,萘可以引起斑马鱼发育阻滞以及卵黄囊水肿等发育畸形。陈宏姗等[6]的研究表明萘暴露可以造成中枢神经发育异常,组织中DNA甲基化水平升高。本研究首次研究了铅和萘的联合毒性,两因素析因设计资料的方差分析结果显示,铅和萘联合暴露对斑马鱼死亡率和孵化率的影响具有明显的交互作用:低剂量的铅和萘单独暴露对胚胎的死亡率和孵化率没有明显影响,但Pb-12+Nap-5联合暴露组的胚胎死亡率与空白对照组、丙酮对照组和同浓度的单独暴露组相比均升高,孵化率与丙酮对照组相比降低。Pb-48+Nap-20联合暴露组与空白对照组、丙酮对照组和同浓度的单独暴露组相比,死亡率升高,孵化率下降,说明铅和萘联合暴露对斑马鱼死亡率和孵化率的交互作用为协同作用。

发育早期,尤其是胚胎发育期的斑马鱼胚胎暴露于外源性有毒物质时可导致卵黄囊水肿、心包水肿和脊柱弯曲等多种发育畸形[15-19],因此形态畸形是评价斑马鱼胚胎发育毒性的一个重要指标。本研究结果显示,高浓度的铅暴露可以造成斑马鱼胚胎脊柱弯曲等畸形,但与对照相比,畸形率的差异不具有统计学意义。此结果与DOU等[17]的研究结果一致,该研究结果显示,铅暴露可以诱导斑马鱼胚胎脊柱出现"S"形弯曲,而且50 μmol/L铅暴露组的"S"形胚胎畸形率较对照组差异无统计学意义。萘是一种公认的致畸物,之前的研究报道也显示萘暴露可以引起斑马鱼胚胎出现发育迟缓、卵黄囊水肿等发育畸形[16]。本研究发现萘暴露组的胚胎出现了包括脊柱弯曲、尾部弯曲、心包囊水肿、卵黄囊水肿和尾部缺失多种发育畸形,而且与丙酮对照组相比,20 μmol/L萘单独暴露组胚胎的畸形率升高,进一步证实萘具有较强的致畸性。两因素析因设计资料的方差分析结果显示,铅和萘联合暴露对斑马鱼畸形率的影响具有明显的交互作用。与空白对照组和丙酮对照组和同剂量的单独暴露组相比,联合暴露组中除了Pb-12+Nap-5组外,其他组别的畸形率都升高,说明铅的存在可以加强萘的致畸性,二者对斑马鱼畸形率的交互作用为协同作用。

心脏是斑马鱼体内的第一功能器官,而心率是评估心脏功能的一项重要参数,因此,近年来很多以斑马鱼为模型的毒理学研究都将心率作为一项重要的检测指标,心率的变化可以反映一些隐藏的病理状态[19-21]。铅和萘单独暴露和联合暴露都能引起心率不同程度的降低,这可能与暴露后的心脏发育畸形(心包囊水肿)有关。心脏功能衰退可以阻滞胚胎的生长发育,并导致血流速度减慢,心脏部位产生积液,进而引起水肿[20]。本研究发现,虽然萘单独暴露和联合暴露后胚胎都出现了心包囊水肿并伴随着一定程度的心率下降,但与对照相比,均无明显的差异,说明铅和萘暴露对斑马鱼胚胎心脏功能的发育并没有明显的影响,而且两者之间无交互作用。

研究表明,铅暴露会造成神经行为的发育障碍,因此被认为是引起儿童神经发育异常的主要危险因素之一,可以造成包括学习记忆障碍和多动症等多种神经系统疾病[22]。但对于萘暴露引起的神经发育毒性鲜见报道。斑马鱼与其他脊椎动物具有很多相似性,而且实验操作简便,主要的脑部结构与人类相比也具有高度的保守性,因此被认为是研究中枢神经系统发育的一个理想的模式生物[17]。斑马鱼胚胎发育持续到72 hpf,大约在22 hpf时胚胎开始出现自主抽动,幼鱼一般在96~120 hpf出现游囊并具备自由泳动的能力,因此可以选择此时间段之后的幼鱼分析其运动活力来反映环境毒物的神经和肌肉毒性作用[22-23]。本研究24 hpf胚胎自主抽动的检测结果显示,高浓度萘暴露和联合暴露组的自主抽动水平都受到抑制,联合暴露对斑马鱼自主抽动的抑制无交互作用。但是低浓度单独暴露组的自主抽动水平与对照组相比差异无统计学意义,而低浓度联合暴露组的自主抽动水平与对照相比降低,说明联合暴露对胚胎自主抽动的影响大于单独暴露。

另外,在本实验中,144 hpf的斑马鱼幼鱼在光周期的明亮期时表现出较低的游动速度,而在黑暗期时游动速度迅速升高。这是因为斑马鱼趋亮避暗,由明转暗的光刺激会使斑马鱼产生规避行为,导致黑暗期出现短暂的游动速度快速升高[24]。与对照组相比,高浓度铅暴露组幼鱼的游动速度在第一黑暗期和第二、三明亮期明显下降,高浓度的萘暴露组的幼鱼的游动速度在每一时期都有下降。两因素析因设计资料的方差分析结果显示,铅和萘联合暴露在第一黑暗期对斑马鱼游动速度的影响具有明显的交互作用,同时第一黑暗期联合暴露组的幼鱼的游动速度较对照组和同浓度的单独暴露组均下降。说明铅和萘暴露具有明显的神经发育毒性,而且联合毒性强于单独毒性,萘的存在可以加强铅暴露造成的神经行为发育障碍,二者对神经发育的交互作用为协同作用。

本研究通过形态学和行为学分析初步确定了铅和萘单独暴露以及联合暴露对于斑马鱼胚胎发育的影响,证明了铅和萘均可影响斑马鱼胚胎的发育,且具有一定的神经毒性,而二者联合暴露对胚胎的死亡率、孵化率、畸形率和幼鱼神经行为的影响具有明显的交互作用。但研究尚存在一些不足之处:一是暴露浓度有限,不能通过模型或作图法来明确铅和萘联合暴露对斑马鱼发育的影响是否存在协同作用;二是缺乏分子水平的研究数据,联合暴露的毒性机制有待进一步研究。

表1

铅和萘的浓度

Table 1 Exposure doses of lead and naphthalene

图 1

铅和萘联合暴露对斑马鱼死亡率(A)和孵化率(B)的影响

Figure 1 Effects of combined exposure to lead and naphthalene on mortality rate(A)and hatching rate(B)of zebrafish embryos

[注]CK:空白对照;Ace:丙酮对照;Pb:铅;Nap:萘。a:与空白对照组比较,P<0.05;b:与丙酮对照组比较,P<0.05;c:与同剂量的铅暴露组比较,P<0.05;d:与同剂量的萘暴露组比较,P<0.05。 [Note]CK: Blank control; Ace: Acetone control; Pb: Lead; Nap: Naphthalene. a: Compared to the blank control group, P < 0.05; b: Compared to the acetone control group, P < 0.05; c: Compared to the lead exposure group at the same dose, P < 0.05; d: Compared to the naphthalene exposure group at same dose, P < 0.05.
图 2

铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎发育畸形的影响

Figure 2 Effects of combined exposure to lead and naphthalene on developmental malformation of zebrafish embryos

[注]A.铅和萘暴露引起的斑马鱼畸形。1:正常斑马鱼;2~6:畸形斑马鱼;SF:脊柱弯曲;TF:尾部弯曲;PE:心包囊水肿;YE:卵黄囊水肿;TD:尾部缺失。B.铅和萘暴露引起斑马鱼畸形率的变化。CK:空白对照;Ace:丙酮对照;Pb:铅;Nap:萘。a:与空白对照组比较,P<0.05;b:与丙酮对照组比较,P<0.05;c:与同剂量的铅暴露组比较,P<0.05;d:与同剂量的萘暴露组比较,P<0.05。 [Note] A.Malformation of zebrafish embryos exposed to lead and naphthalene. 1: Normal zebrafish; 2-6: Abnormal zebrafish; SF: Spinal flection; TF: Tail flection; PE: Pericardial edema; YE: Yolk edema; TD: Tail deficiency. B.Changes of malformation rate for zebrafish embryos exposed to lead and naphthalene. CK: Blank control; Ace: Acetone control; Pb: Lead; Nap: Naphthalene. a: Compared to the blank control group, P < 0.05; b: Compared to the acetone control group, P < 0.05; c: Compared to the lead exposure group at the same dose, P < 0.05; d: Compared to the naphthalene exposure group at same dose, P < 0.05.
图 3

铅和萘联合暴露对斑马鱼胚胎自主抽动(A)和心率(B)的影响

Figure 3 Effects of combined exposure to lead and naphthalene on spontaneous movemen(t A)and heart rate(B)of zebrafish embryos

[注]CK:空白对照;Ace:丙酮对照;Pb:铅;Nap:萘。a:与空白对照组比较,P<0.05;b:与丙酮对照组比较,P<0.05;c:与同剂量的铅暴露组比较,P<0.05;d:与同剂量的萘暴露组比较,P<0.05。 [Note]CK: Blank control; Ace: Acetone control; Pb: Lead; Nap: Naphthalene. a: Compared to the blank control group, P < 0.05; b: Compared to the acetone control group, P < 0.05; c: Compared to the lead exposure group at the same dose, P < 0.05; d: Compared to the naphthalene exposure group at same dose, P < 0.05.
图 4

铅和萘联合暴露对斑马鱼幼鱼游动速度随光周期变化的影响

Figure 4 Effects of combined exposure to lead and naphthalene on swimming speed of zebrafish larvae after a light-to-dark photostimulation

[注]CK:空白对照;Ace:丙酮对照;Pb:铅;Nap:萘。a:与空白对照组比较,P<0.05;b:与丙酮对照组比较,P<0.05;c:与同剂量的铅暴露组比较,P<0.05;d:与同剂量的萘暴露组比较,P<0.05。 [Note]CK: Blank control; Ace: Acetone control; Pb: Lead; Nap: Naphthalene. a: Compared to the blank control group, P < 0.05; b: Compared to the acetone control group, P < 0.05; c: Compared to the lead exposure group at the same dose, P < 0.05; d: Compared to the naphthalene exposure group at the same dose, P < 0.05.

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[基金项目] 国家自然科学基金青年科学基金项目(编号:11605255);兰州市科技计划项目(编号:2015-3-75)

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[收稿日期] 2017-09-01

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