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2018, 35(5):438-442.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2018.17535

孕鼠常见微波暴露对仔鼠行为发育及认知的影响


1a. 昆明医科大学 公共卫生学院, 云南 昆明 650500 ;
1b. 昆明医科大学 生物工程中心, 云南 昆明 650500 ;
1c. 昆明医科大学 研究生部, 云南 昆明 650500 ;
2. 西安市碑林区长乐坊社区卫生服务中心, 陕西西安 710048

收稿日期: 2017-08-28;  发布日期: 2018-06-02

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:40115048)

通信作者: 吴锡南, Email: xinanwu2015@163.com  

作者简介: 李志强(1992-), 男, 硕士生; 研究方向:劳动卫生与环境卫生学; E-mail:

[目的] 探究孕鼠暴露于常见微波频段对仔鼠行为发育及认知的影响。

[方法] 健康7周龄SPF级Wistar大鼠36只,雌雄鼠比例为2:1,合笼交配后将孕鼠随机分为四组(单暴露组、双暴露组、与暴露组对应的两个对照组),每组6只。单暴露组接受1.8 GHz(常见的手机信号频段)微波;双暴露组接受1.8 GHz和2.4 GHz(常见的WiFi频段)叠加的微波,微波强度均为1.0 mW/cm2。暴露时间为12 h/d,从孕0 d至孕20 d。暴露期间动物自由饮水和饮食,背景条件稳定。暴露完成后,观察并测量仔鼠的生理发育和行为发育指标,仔鼠7周龄后取海马组织,用高效液相色谱仪检测海马中4种神经递质(谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、天冬氨酸)含量。

[结果] 两个对照组的指标差异无统计学意义,予以合并。单暴露组和双暴露组仔鼠的体重[(5.61±0.47)g和(5.36±0.53)g]低于合并对照组[(6.02±0.59)g],睁眼时间[(16.67±0.52)d和(17.00±0.00)d]长于合并对照组[(15.40±0.52)d],前肢悬挂达标日龄[(10.17±0.41)d和(10.17±0.41)d]短于合并对照组[(10.80±0.63)d],差异均有统计学意义(均P < 0.05)。双暴露组的谷氨酸表达量[(589.89±84.04)μg/g]低于合并对照组[(741.00±151.58)μg/g]和单暴露组[(742.91±274.95)μg/g](均P < 0.05),其余3种神经递质表达量组间差异无统计学意义(均P>0.05)。

[结论] 孕鼠暴露于1.8 GHz和2.4 GHz叠加微波场,对仔鼠行为发育及认知有负面影响。

关键词: 孕期暴露;  微波;  发育;  行为;  认知;  神经递质;  手机;  WiFi 

电磁辐射作为一种环境因子长期存在于人类的生存空间,根据其频率、强度、暴露方式、暴露时间等因素的不同可对健康产生不同程度的影响。随着移动通信技术的快速发展,人类暴露于微波的机会大大增加。已有大量文献报道,长期暴露于微波(主要是移动通信设备,如:基站、手机、路由器等)可能与神经衰弱综合征[1-2]、脑肿瘤[3-4]、心脑血管疾病[5]、生殖能力下降[6]、阿尔茨海默病[7]等有关。目前,关于妊娠期暴露于手机和无线路由器信号叠加的微波对子代的发育、认知有何影响却鲜有报道。本研究采用1.8 GHz(手机常用频段)叠加2.4 GHz(WiFi常用频段)对孕鼠进行处理,通过检测其后代的生理、行为发育状况及海马组织内与学习记忆有关的氨基酸类神经递质的变化,研究这种叠加的常见微波的毒性。

1   材料与方法

1.1   仪器与试剂

8592C频谱分析仪(惠普,美国),Model7620微波辐射测试仪(Narda,美国),8614A信号发生装置、信号放大器(惠普,美国),TX-B8H WiFi 2.4 GHz发射装置(深圳市特信电子有限公司,中国),Morris水迷宫视频分析系统(上海吉量软件科技有限公司,中国),高效液相色谱仪(Hitachi,日本),CL-31R高速冷冻离心机(Thermo,美国),SK5200LHC超声波清洗器(上海科导仪器有限公司,中国),PB-10pH计(赛多丽丝中国仪器公司,中国),HH.SY11-NI2B恒温电热水浴锅(北京市长风仪器仪表公司,中国),AR1140/C电子分析天平(OHAUS,美国),XW-80A涡旋混合器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司,中国),KXH 202-2A恒温干燥箱(上海科析实验仪器厂,中国)。谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、天冬氨酸标准品(上海源叶生物科技有限公司,中国),2,4-二硝基氟苯(Sigma,美国),色谱纯级甲醇、色谱纯级乙腈(Merck,德国)。

1.2   动物分组

实验动物为36只健康7周龄SPF级Wistar大鼠,由上海斯莱克实验动物公司提供[动物许可证号:SCXK(沪)2012-0002],其中雌鼠24只(150~200 g),雄鼠12只(200~250 g)。适应环境1周后,雌雄鼠以2:1比例于每晚18:00合笼交配,次日清晨进行阴道涂片检查,涂片结果精子阳性为已交配鼠,当日作为孕0 d。将孕鼠随机分为单暴露组和单对照组,双暴露组和双对照组(每组6只,后发现两个对照组中各有1只为假孕),分成两批进行实验。单暴露组只接受1.8 GHz微波,双暴露组接受1.8 GHz和2.4 GHz叠加的微波,两个对照组不接受微波。大鼠饲养在昆明医科大学公共卫生学院动物饲养室,饲养室环境条件稳定,平均温度:22℃,平均湿度:52%,通风、光照良好。动物饲养期间自由饮食饮水,孕期定时定量给予市售瓜子和奶粉加强营养。

1.3   动物电磁辐射暴露模型的建立

参照德国电信公司为德国国家环境与健康研究中心毒理所提供的标准欧洲数字式全球移动通信系统(GSM)移动通信暴露室,自制暴露装置(图 1)。整个装置由两个独立的(70×60×220)cm3空间组成(左侧为对照室,右侧为暴露室),室内壁用铜箔屏蔽外界电磁场干扰,两室底部放置有机玻璃制成的(60× 40×20)cm3饲养箱,两种微波装置位于暴露室内饲养箱上方。信号发生装置置于暴露室外侧上方,通过线缆连接到暴露室内的信号放大器,产生1.8 GHz微波。信号放大器可以调节高度,位于饲养箱上方约100 cm处。无线路由器作为WiFi信号发生器产生2.4 GHz微波,悬挂于1.8 GHz信号放大器与饲养箱之间,位于饲养箱上方约30 cm处。暴露强度通过Narda微波辐射测试仪于饲养箱内测量,测得功率密度为1.0 mW/cm2。国际非电离辐射防护委员会建议,1.8 GHz的公众暴露限值为0.9 mW/cm2,2.4 GHz的公众暴露限值为1 mW/cm2[8],且根据本课题组以往研究综合考虑,设定本次研究暴露功率密度为1.0 mW/cm2。暴露时间为12 h/d,从孕0 d至孕20 d。实验时,暴露组和对照组同时分别饲养于暴露装置的暴露室和对照室的饲养箱内(分2批完成,先单暴露组和单对照组,再双暴露组和双对照组)。当暴露室开始暴露时,对照室内上述频宽范围功率密度波动于30~70 μW/cm2

图 1

自制微波暴露装置

1.4   仔鼠生理和行为发育指标

生理发育指标:记录各组仔鼠出生时体重、身长、尾长、每窝数量和性别比,以及每窝仔鼠全部张耳、门牙萌出、睁眼的时间。行为发育指标:从仔鼠出生第2天开始进行行为发育指标测试,包括断崖回避、平面翻正、听觉惊愕、前肢悬挂、空中翻正以及视觉定位,记录各指标的达标日龄。

1.5   神经递质含量的测定

仔鼠海马组织内与学习记忆有关的氨基酸类神经递质用2,4-二硝基氟苯衍生法和高效液相色谱法测其含量。具体步骤:待仔鼠7周龄时,采用随机数表法分别从单暴露组和单对照组抽取仔鼠各8只,从双暴露组与双对照组抽取仔鼠各8只,雌雄各半,共32只进行测定。冰面上断头,取海马组织并称重,按1:10的比例加入甲醇溶液(甲醇:水=1:1,体积比),后用组织匀浆机匀浆,匀浆后装入EP管,-80℃保存。取海马组织匀浆150 μL,加入等体积乙腈,涡旋1 min后4℃、12 000 r/min(离心半径6 cm)离心10 min取上清。将海马组织上清液或者标准品溶液(质量浓度为100 μg/mL的谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、天冬氨酸标准液)加入3 mL容量瓶中,加入预先制备好的600 μL Na2CO3-NaHCO3(0.5 mol/L,pH=9)缓冲盐溶液,再加入600 μL 1% 2,4-二硝基氟苯,于水浴锅中60℃衍生60 min后取出,立即用0.1 mol/L的KH2PO4溶液定容至3mL,进样20μL,手动积分获得峰面积积分值。流动相A为乙腈-醋酸钠缓冲盐溶液(0.05 mol/L,pH=5,体积比为1:1),流动相B为pH=5、0.05 mol/L的醋酸钠缓冲盐溶液,柱温30℃,流速1 mL/min,检测波长为350 nm。天冬氨酸保留时间为10.197 min,谷氨酸为13.103 min,甘氨酸为16.687 min,γ-氨基丁酸为27.710 min,4种对照品峰型尖锐、对称,与溶剂峰完全分离;海马组织样品中4种氨基酸类神经递质色谱峰与溶剂峰和杂质峰达到基线分离。

1.6   统计学分析

实验数据以x±s表示,采用SPSS 17.0进行统计分析,服从正态分布且方差齐性的数据采用t检验、方差分析(两两比较采用LSD和SNK法)进行处理,不服从正态分布或方差不齐时,采用秩和检验。当两个对照组差异无统计学意义则将两组合并,有差异则分别将各暴露组与对照组进行比较。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   仔鼠生理发育指标

所有仔鼠外观均无明显异常。单对照组和双对照组的指标差异均无统计学意义,故将两个对照组各指标合并(后同)。各组仔鼠身长、尾长及张耳、萌牙时间的差异无统计学意义(P > 0.05)。两个暴露组仔鼠的体重均低于对照组(P < 0.05),双暴露组低于单暴露组(P < 0.05)。两个暴露组仔鼠睁眼时间均较对照组睁眼时间延长(P < 0.05),但两个暴露组间差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 1

表1

孕鼠微波辐射暴露后仔鼠各指标的比较(x±s

2.2   仔鼠行为发育指标

各组断崖回避、平面翻正、听觉惊愕、视觉定位达标日龄差异均无统计学意义(P > 0.05)。两个暴露仔鼠的前肢悬挂达标日龄低于对照组,但两个暴露组间差异无统计学意义(P > 0.05)。两个暴露组与对照组的空中翻正达标日龄差异均无统计学意义(P > 0.05),单暴露组低于双暴露组(P < 0.05)。见表 1

2.3   仔鼠神经递质含量

两两比较显示,双暴露组仔鼠谷氨酸表达量低于单暴露组和对照组(P < 0.05),其余3种神经递质表达量组间差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 1

3   讨论

发育毒性常用来评价外源性化学物质或外界环境因素对生物个体的影响。在母体受孕前期、胚胎发育期和出生后直至性成熟期,由于有害因素暴露而对生物个体产生不良作用,则该有害因素具有发育毒性,其不良作用称为发育毒性作用。发育毒性主要表现为发育个体死亡、结构异常、生长发育迟缓和功能缺陷或缺失等方面。

近年来,随着移动通讯数据及互联网业务的发展,移动信号基站的数量及密度不断增大,由此产生的电磁辐射使人群处于复杂的电磁环境中。关于电磁辐射产生发育毒性的报道,ZHANG等[9]研究发现,孕鼠妊娠3.5~18 d暴露于9.417 GHz电磁场可影响仔鼠行为,仔鼠在旷场实验和高架迷宫实验中活动减少,焦虑行为增加。张媛等[10]将孕期大鼠暴露于功率密度为0.5、1.0 mW/cm2的1.8 GHz电磁辐射中,发现发育期和成年期子代大鼠海马细胞凋亡率升高。胚胎发育早期对外界环境因素极为敏感,本研究欲探究手机与WiFi叠加的微波暴露是否影响子代的神经和行为发育,国际通用的手机频段和WiFi频段分别为1.8 GHz和2.4 GHz,故选择两者叠加对大鼠进行孕期暴露。

本研究显示,1.8 GHz和2.4 GHz叠加微波暴露对仔鼠体重、睁眼时间有影响,对前肢悬挂的影响还需进一步验证。该结果与王晓丽等[11]研究结果不一致,其发现孕鼠暴露于900 MHz电磁辐射对子代体重和睁眼时间均无影响,对断崖回避达标日龄有影响。产生结果差异的原因可能有以下几个方面:①暴露的强度、方式不同。②操作时存在时间误差,本实验操作时主要靠肉眼观察小鼠前肢脱离铁圈时即刻按下计时器,可能影响所记录的时间。③每窝仔鼠数量的差异,由于每窝仔鼠数量的不同,可能存在仔鼠数量少、体重高的窝别达标日龄要早于仔鼠数量多、体重轻的窝别。

学习和记忆是哺乳动物的高级神经活动,受多种因素调控。而哺乳动物的中枢神经系统在胚胎发育的早期已经形成,该时期对于外界环境因素极为敏感,暴露于有害物质或因素则可能对中枢神经系统产生影响。中枢神经系统是电磁辐射的敏感靶部位,孕期的环境因素暴露对子代的发育及神经系统是否有影响已成为研究的热点。海马作为脊椎动物脑内重要器官,与学习记忆有密切关系。学习记忆的生物学基础为突触的可塑性,即长时程增强和长时程抑制传递效能的可变性。有研究表明,电磁辐射引起认知功能障碍表现在神经细胞凋亡、海马组织病理损伤和超微结构变化、脑组织中所含有的与学习和记忆相关的神经递质及受体的变化[12]。本实验通过测量海马中对突触可塑性有调控的氨基酸类神经递质的含量变化,来反映叠加辐射强度对子鼠的神经发育的影响,从而间接反映该暴露条件对仔代学习认知功能的影响。被测氨基酸包括兴奋性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和抑制性氨基酸甘氨酸、γ-氨基丁酸。其中,天冬氨酸和谷氨酸共同参学习与记忆的信息传递过程。天冬氨酸的衍生物N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methy l-D-aspartate receptor,NMDA)是谷氨酸的离子型受体之一,与谷氨酸的AMPA亚型和KA亚型组成谷氨酸离子受体家族,是介导突触兴奋性传递过程的受体-通道复合物,与发育过程中枢神经系统神经网络的形成,以及学习和记忆密切相关的长时程增强和长时程抑制突触传递效率的可塑性变化等密切相关[13-14]。抑制性氨基酸类神经递质甘氨酸和γ-氨基丁酸在信息传递过程也起重要作用。海马中甘氨酸有两个不同的结合位点,分别为抑制性甘氨酸受体结合位点和兴奋性谷氨酸离子型受体NMDA受体的共激活位点,前者对神经传递起抑制作用,后者对神经传递起兴奋作用。此外,甘氨酸受体和γ-氨基丁酸A型受体能够交互作用于中枢神经系统,引起氯离子内流和神经系统的超极化反应[15]

本研究最终结果表明:与对照组和单暴露组比较,1.8 GHz与2.4 GHz叠加微波暴露下的仔鼠海马组织谷氨酸表达量下调(P < 0.05)。该结果与李红玉等[16]用6×104 V/m电磁脉冲(脉冲上升时间20 ns,脉宽30 μs,频率2.5脉冲/min)辐射大鼠2 min的结果一致,辐射结束后即刻、3 h、6 h测得的谷氨酸含量与对照相比明显下降。

综上所述,1.8 GHz与2.4 GHz叠加微波暴露可能对仔鼠行为发育和认知产生影响。由于暴露条件、暴露方式及测量方法不一致,此结果有待进一步验证,尚不能外推到人体。

图 1

自制微波暴露装置

Figure 1
表1

孕鼠微波辐射暴露后仔鼠各指标的比较(x±s

Table 1

参考文献

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:40115048)

[作者简介] 李志强(1992-), 男, 硕士生; 研究方向:劳动卫生与环境卫生学; E-mail: 973670025@qq.com

[收稿日期] 2017-08-28 00:00:00.0

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