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2018, 35(12):1123-1128.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2017.18558

内质网应激在二甲基甲酰胺致小鼠肝脏损伤中的作用


中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所, 北京 100050

收稿日期: 2018-09-04;  发布日期: 2019-01-07

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号:81372963)

通信作者: 程娟, Email: chengjuan0609@126.com  

作者简介: 王磊(1991-), 男, 硕士生; 研究方向:卫生毒理学; E-mail:

[目的] 研究内质网应激在二甲基甲酰胺(DMF)亚急性染毒致小鼠肝脏损伤中的作用及机制。

[方法] 8周龄雄性C57BL/6小鼠20只,随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,各5只。DMF灌胃剂量分别为150 mg/kg·bw(低)、450 mg/kg·bw(中)、1 350 mg/kg·bw(高),对照组给予同等体积生理盐水。连续灌胃28 d,1次/d。末次染毒结束后,次日解剖。生化分析仪检测小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的水平,HE染色观察肝脏组织病理学改变,Western blot法检测内质网应激标志性蛋白GRP94、GRP78及DMF代谢酶CYP2E1的表达水平。

[结果] DMF各染毒组小鼠体重增长受到抑制,与对照组相比差异均有统计学意义(P < 0.05),且随染毒剂量增加,抑制程度加重。与对照组相比,中、高剂量组小鼠肝脏系数增大,差异均有统计学意义(P < 0.05)。中、高剂量组血清ALT水平升高,与对照组相比,差异有统计学意义(P < 0.05),且高剂量组ALT水平较中剂量组高,差异有统计学意义(P < 0.05)。DMF染毒组AST水平也表现出升高,但低、中剂量组与对照组相比,差异均无统计学意义(P > 0.05),高剂量组与其他组相比,差异均有统计学意义(P < 0.05)。肝脏病理学检测显示,低剂量组小鼠肝小叶汇管区周围可见细胞水肿,细胞质疏松浅染,出现空泡;中剂量组出现大面积细胞水样变性,细胞肿胀,细胞核皱缩,肝窦扩张;高剂量组中央静脉周围出现大量细胞嗜酸性变,胞浆浓缩,细胞核固缩,出现嗜酸小体;对照组小鼠未见异常改变。Western blot结果显示,低、中、高剂量组的GRP94、CYP2E1表达水平升高,与对照组相比差异均有统计学意义(P < 0.05),且GRP94的表达水平随染毒剂量的升高呈剂量-效应关系。中、高剂量组GRP78表达水平与对照组相比,差异均有统计学意义(P < 0.05)。

[结论] DMF亚急性染毒可导致小鼠肝脏损伤,其机制可能与内质网应激有关。

关键词: 二甲基甲酰胺;  亚急性;  内质网应激;  CYP2E1;  肝损伤 

N, N-二甲基甲酰胺(N, N-dimethylformamide, DMF)是一种无色透明、溶解能力很强的酰胺类有机化合物, 因其既能溶于水又能溶于大多数有机物, 被称为"万能有机溶剂", 广泛应用于有机合成、制药、染料、皮革生产等多种行业[1-2], 职业接触人群广泛。职业流行病学调查显示, DMF可导致肝功能异常, DMF累积接触量与肝损伤累积发病率存在剂量-反应关系[3]。国内开展的DMF职业健康风险评估中指出, 职业接触DMF可引起接触工人食欲减退、恶心、呕吐、肝区痛、肝功能异常率升高[4]。DMF导致的肝损伤目前尚无特效治疗药, 且近年来DMF中毒事件时有报道[5-7], 因此有必要开展DMF引起肝脏损伤的机制研究。

由于DMF主要经肝脏细胞色素P450(CYP2E1)酶代谢, 产生的活性代谢产物和活性氧会对细胞产生毒性作用[8]。内质网富含P450酶系, 是参与毒物解毒, 蛋白合成、修饰和折叠的重要细胞器。毒物经CYP2E1代谢活化会引起内质网稳态失衡, 导致内质网腔内未折叠蛋白、错误折叠蛋白聚集, 诱导内质网应激, 因此内质网应激可能是DMF导致肝细胞损伤的机制之一。内质网应激参与多种环境和职业毒物对细胞的毒性作用, 当内质网应激反应过强或刺激时间过长, 则会诱导细胞凋亡, 引起机体损伤[9]。有研究指出, DMF可导致肝细胞凋亡[8, 10], 但DMF是否通过内质网应激诱导肝细胞的凋亡机制尚未明确。

由于职业接触过程中, 多以低剂量重复暴露为主, 因此本研究通过短期重复暴露的方式研究DMF的亚急性毒性肝损伤, 通过检测内质网应激标志性蛋白葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94, GRP94)和葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78), 以及DMF的代谢酶CYP2E1的表达水平, 探讨内质网应激是否参与DMF所致的肝脏损伤, 为DMF引起肝损伤的防治提供理论依据。

1   材料与方法

1.1   主要试剂与仪器

DMF (美国Sigma), GRP94抗体、GRP78抗体、CYP2E1抗体、GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)抗体(美国Abcam), BCA蛋白定量试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司), AU480全自动生化分析仪(日本贝克曼), 低温高速离心机(上海安亭), M200酶标仪(瑞士TECAN), DYY-6C电泳仪(北京六一), BX43光学显微镜(日本OLYMPUS)。

1.2   动物分组与处理

SPF级健康成年雄性C57BL/6小鼠20只, 8周龄, 体重为20~22 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养温度20~23℃, 相对湿度40%~70%, 动物自由进食饮水, 昼夜节律正常。适应性喂养1周后, 随机分为4组, 每组5只。C57BL/6小鼠DMF经口染毒LD50=3 000 mg/kg·bw, 本研究以1/20 LD50作为低剂量组(150 mg/kg·bw)染毒剂量, 3倍剂量间距设置中、高剂量组染毒剂量(450、1 350 mg/kg·bw)。染毒组小鼠给予DMF灌胃, 对照组小鼠给予同等体积生理盐水灌胃, 连续灌胃28 d, 1次/d, 末次染毒结束后, 次日解剖。

1.3   体重与脏器系数

试验期间每周记录小鼠体重, 处死前称小鼠体重, 解剖后称取肝脏重量, 计算肝脏系数并记录。肝脏系数=(肝脏重量/处死前体重)×100%。

1.4   肝功能检测

摘眼球收集血液于促凝采血管中, 室温静止30min后, 3 000 r/min, 离心半径20 cm, 离心10 min, 取上层血清于0.6 mL EP管中, 上机检测。检测指标包括丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)。

1.5   肝组织病理学检测

取小鼠肝脏左叶于10%福尔马林中固定, 经梯度酒精逐级脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红(hematoxylin-erosin staining, HE)染色, 光学显微镜观察小鼠肝脏组织的病理改变。

1.6   Western blot检测肝脏GRP94、GRP78、CYP2E1的表达水平

准确称取新鲜肝脏组织100 mg, 加入0.9 mL含有苯甲基磺酰氟(phenylmethane sulfonyl fluoride, PMSF)的RIPA裂解液(radio-immunoprecipitation assay buffer), 冰上裂解30 min, 制备10%肝匀浆, 离心收集上清蛋白并定量。加入SDS-PAGE上样缓冲液, 沸水浴5 min, 蛋白充分变性后, 等量上样, 进行SDS凝胶电泳, 聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜恒流转膜, 5%脱脂牛奶室封闭2 h, 分别加入一抗GRP94 (V:V=1:1 000)、GRP78(V:V=1:1 000)、CYP2E1 (V:V=1:500)、GAPDH (V:V=1:2 000), 4℃孵育过夜。1×TBST洗膜3次, 10 min/次, 加入二抗室温孵育2 h, 1×TBST洗膜3次, 10 min/次, ECL化学发光显影并拍照。Quantity One软件进行灰度值分析, 计算目的蛋白的相对表达量。

1.7   统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件处理数据, 结果均采用均数±标准差的形式表示, 组间比较采用单因素方差分析, 方差分析前进行方差齐性检验, 多组间两两比较采用LSD检验, 检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   体重

对照组小鼠生长发育正常, 体重随周龄逐渐升高。低、中、高剂量组小鼠生长发育受到不同程度的抑制, 体重增长缓慢, 且在染毒7 d均出现体重下降, 与对照组相比, 差异均有统计学意义(P<0.05);之后体重开始缓慢增长, 但与对照组相比, 体重增长仍受到抑制, 且随染毒剂量增加, 抑制程度加重。见表 1

表1

二甲基甲酰胺染毒后各组小鼠体重变化

2.2   肝脏系数

对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠肝脏系数分别为(4.63±0.20)、(4.76±0.11)、(5.30± 0.11)、(5.64±0.09)。与对照组相比, 中、高剂量组小鼠肝脏系数增大, 差异均有统计学意义(P<0.05);高剂量组肝脏系数均高于其他组, 差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3   肝功能

血生化结果显示, 中、高剂量组小鼠血清ALT水平升高, 与对照组相比, 差异有统计学意义(P<0.05), 且高剂量组ALT水平较中剂量组高, 差异有统计学意义(P<0.05)。DMF染毒后, AST水平也表现出升高, 但低、中剂量组与对照组相比, 差异均无统计学意义(P>0.05), 高剂量组与其他组相比, 差异均有统计学意义(P<0.05), 见表 2

表2

二甲基甲酰胺染毒28d后各组小鼠血清ALT、AST水平(U/L,n=5)

2.4   肝脏组织病理学改变

HE染色显示, 对照组小鼠肝细胞形态正常, 细胞核大而圆, 染色质均匀, 核仁清晰, 小叶结构完整, 细胞成条索状分布, 未见细胞水肿。低剂量组小鼠肝脏汇管区可见细胞水肿, 细胞质疏松浅染, 出现空泡。中剂量组小鼠肝脏出现大面积细胞水样变性, 细胞肿胀, 细胞核皱缩, 肝窦扩张。高剂量组小鼠肝脏中央静脉周围出现大量细胞嗜酸性变, 胞浆浓缩, 细胞核固缩, 出现嗜酸小体, 见图 1

图 1

二甲基甲酰胺染毒28d后各组小鼠肝脏病理图(HE染色,×100)

2.5   GRP94、GRP78、CYP2E1表达

低、中、高剂量组的GRP94表达水平升高, 与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05), 且GRP94的表达水平随染毒剂量的升高呈剂量-效应关系。中、高剂量组GRP78表达水平与对照组相比, 差异均有统计学意义(P<0.05), 且高剂量组与低、中剂量组相比, GRP78的表达水平也升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量组的CYP2E1表达水平也较对照组升高, 差异均有统计学意义(P<0.05), 且高剂量组与低、中剂量组相比, CYP2E1的表达水平升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。见图 2

图 2

二甲基甲酰胺染毒28d后各组小鼠肝脏GRP94、GRP78、CYP2E1蛋白表达

3   讨论

DMF是工业上广泛应用的有机溶剂, 我国DMF的使用主要在江苏、浙江、广东、广西等沿海地区皮革制造行业。近几年DMF中毒事件时有发生, 其主要临床表现为恶心呕吐、腹部痛、不同程度的肝功能损害[7, 11]。动物实验已证实DMF主要导致肝脏损伤, 急性毒性主要表现为肝脏中央静脉周围肝细胞坏死、炎细胞浸润、肝细胞水样变性等病理改变[10, 12]。本课题组前期的亚急性毒性试验也表明, 在低剂量DMF暴露下主要引起肝脏汇管区细胞严重水样变性, 伴有炎症细胞浸润[13]。本次研究发现, 不同DMF染毒剂量对小鼠造成了不同程度的肝损伤, 随染毒剂量的增大, 肝损伤的严重程度也随之加重。染毒7 d各组小鼠出现体重下降, 高剂量组小鼠体重下降尤为明显, 体重约下降初始体重的10%。后期DMF染毒组小鼠体重缓慢恢复, 但与对照组小鼠相比, 生长发育仍受到抑制。肝脏系数、ALT、AST水平也因DMF染毒升高, 并且随染毒剂量的增大, 肝功能损伤加重。组织病理学结果显示, 低剂量组小鼠肝脏中间带细胞水样变性, 围绕汇管区呈花环样分布; 中剂量组细胞水样变性加重伴有肝窦严重扩张, 细胞核形态异常; 高剂量组小鼠肝细胞出现大量嗜酸性改变, 胞浆浓缩, 细胞核固缩, 出现嗜酸小体, 这种损伤可能与DMF诱发肝细胞凋亡有关。

当各种生理病理因素引起内质网稳态失衡, 内质网腔内未折叠蛋白、错误折叠蛋白聚集时, 可诱导内质网应激[14-15]。非折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)是由于错误折叠或未折叠蛋白不能及时清除而积聚在内质网中, 促使内质网应激相关蛋白的表达, 如通过编码伴侣蛋白的基因GRP94和GRP78等转录上调, 以促进蛋白质的正确折叠来保护细胞, 抵御应激诱导所造成的危害, 因此GRP78和GRP94被认为是内质网应激的标志蛋白[14, 16]。乙醇、四氯化碳可引起肝脏内质网应激, 诱导GRP78高表达[17-18], 丙烯酰胺可通过IRE1-GRP78-CHOP信号通路诱导神经细胞凋亡[19], D-半乳糖胺/脂多糖可诱导内质网应激导致急性肝损伤, 也表现出GRP78、GRP94的高表达等[20]

CYP2E1是一种肝脏中高水平表达的膜蛋白, 占细胞色素P450 mRNA总数的近50%[21], 活性形式分布在细胞内质网和线粒体膜上, 主要代谢外源性相对分子质量小的药物、毒物、环境污染物或内源性小分子化合物如酮体、脂肪酸等[22]。DMF属于小分子化合物, 主要通过CYP2E1的氧化作用, 生成活性代谢产物异氰酸甲酯(methyl isocyanate, MIC), MIC具有亲电活性, 可与蛋白质、核酸等细胞大分子物质共价结合而造成肝脏损害。CYP2E1主要位于内质网上, 因此内质网极易在活性代谢产物MIC的攻击下发生稳态失衡。本试验结果显示, DMF连续暴露可引起肝脏GRP94、GRP78蛋白的上调, 且表达水平呈剂量依赖性升高, 与KIM等[23]研究结果一致, 证明DMF可诱发肝脏内质网应激的UPR通路, 这与肝脏系数、肝功能改变、病理改变结果一致。本试验结果也显示, DMF可诱导CYP2E1的表达, 随染毒浓度增加, CYP2E1表达水平升高, 肝损伤加重, 表明肝细胞内质网应激可能与DMF代谢活化引起的亚急性肝损伤有关, 但更明确的信号通路或生物学事件需进一步研究。

综上所述, 内质网应激可能在DMF连续暴露导致小鼠肝损伤中发挥作用, 关于DMF通过内质网应激导致肝细胞凋亡的具体机制还需进一步研究。

表1

二甲基甲酰胺染毒后各组小鼠体重变化

Table 1
表2

二甲基甲酰胺染毒28d后各组小鼠血清ALT、AST水平(U/L,n=5)

Table 2
图 1

二甲基甲酰胺染毒28d后各组小鼠肝脏病理图(HE染色,×100)

Figure 1 [注]A:对照组;B:低剂量组;C:中剂量组;D:高剂量组;O:细胞空泡样变;:肝窦扩张;:嗜酸小体。
图 2

二甲基甲酰胺染毒28d后各组小鼠肝脏GRP94、GRP78、CYP2E1蛋白表达

Figure 2 [注]a:与对照组相比, P<0.05;b:与低剂量组相比, P<0.05;c:与中剂量组相比,P<0.05。

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:81372963)

[作者简介] 王磊(1991-), 男, 硕士生; 研究方向:卫生毒理学; E-mail: threestones_edu@163.com

[收稿日期] 2018-09-04 00:00:00.0

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