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2018, 35(1):49-54.doi:10.13213/j.cnki.jeom.2017.17510

壹期煤工尘肺患者外周血白细胞亚群水平及意义


1. 开滦总医院检验科, 河北 唐山 063000 ;
2. 北京协和医院风湿免疫科, 北京 100032

收稿日期: 2017-08-15;  发布日期: 2018-05-14

通信作者: 袁宝军, Email: ybj25999@163.com  

作者简介: 袁宝军(1966-), 男, 硕士, 主任技师; 研究方向:临床免疫学检验及相关研究; E-mail:

[目的] 探讨壹期煤工尘肺(CWP)患者外周血白细胞亚群水平变化及意义。

[方法] 采用五色流式细胞术检测66例壹期CWP患者(CWP组)、47例与CWP组相同接尘条件的井下接尘矿工(接尘组)及40例非接尘的井上健康工人(非接尘组)外周血白细胞亚群水平,并根据CWP组中是否吸烟、有无并发症、接尘年限及肺功能损伤程度进行分析。

[结果] 与非接尘组[3.76%(2.97%~4.94%)、5.63%(4.69%~6.63%)、6.12%(5.14%~7.21%)、2.07%(1.28%~3.03%)、0.79%(0.58%~0.98%)]相比,CWP组外周血B淋巴细胞、CD16-单核细胞、总单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞水平[4.47%(3.41%~5.92%)、6.47%(5.71%~7.81%)、6.88%(6.18%~8.45%)、2.70%(2.07%~3.80%)、0.97%(0.76%~1.22%)]增高,差异均有统计学意义(P < 0.05);与接尘组[3.94%(3.25%~4.59%)、2.04%(1.13%~3.29%)、7.50%(5.91%~11.13%)]相比,CWP组外周血B淋巴细胞、嗜酸性粒细胞水平[4.47%(3.41%~5.92%)、2.70%(2.07%~3.80%)]增高,细胞毒性T+NK[6.44%(4.47%~9.16%)]降低,差异有统计学意义(P < 0.05);接尘组外周血细胞毒性T+NK细胞、总单核细胞、CD16-单核细胞水平高于非接尘组,差异有统计学意义(P < 0.05);3组中性粒细胞差异无统计学意义(P > 0.05)。CWP组中,与非吸烟者相比,吸烟者外周血总淋巴细胞、B淋巴细胞增高,成熟中性粒细胞降低,差异均有统计学意义(P < 0.05)。其他相关临床指标间比较,白细胞亚群水平差异均无统计学意义(P > 0.05)。

[结论] 壹期CWP患者白细胞亚群(B淋巴细胞、细胞毒性T+NK细胞及嗜酸性粒细胞)水平异常,吸烟可能影响CWP患者白细胞亚群水平。

关键词: 煤工尘肺;  五色流式细胞术;  白细胞亚群 

煤工尘肺(coal workers’ pneumoconiosis,CWP)为煤矿工人长期吸入煤尘和矽尘引起的肺组织弥漫性纤维化疾病,其发病机理仍不明确。研究表明,粉尘颗粒进入机体导致巨噬细胞活化或损伤,释放细胞毒性氧化剂、蛋白酶、细胞因子,促使炎症细胞到达肺泡上皮细胞表面引起肺泡炎症和损伤,而炎症细胞所释放的毒性氧衍生物和蛋白水解酶可进一步引起细胞DNA损伤、细胞凋亡和相关的细胞外基质沉积,导致肺纤维化的发生[1]。以往对CWP的机制研究主要涉及CD4+T、CD8+T、CD16+CD56+NK、CD19+B等淋巴细胞亚型[2-4],中性粒细胞、CD16+和CD16-单核细胞、细胞毒性T+NK等细胞群体是否与CWP发生有关,国内外鲜有报道。运用五色/六抗体CytoDiff组合试剂并结合流式细胞技术分类计数外周血白细胞,不仅可分类出中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等常规细胞,还可检测出CD16+单核细胞、T/NK细胞、B淋巴细胞、原始细胞等[5]。CytoDiff方法在计数未成熟细胞方面具有特异、敏感、快速的特点,可以快速对患者进行后续检测[6],在感染、免疫、血液系统、肿瘤等领域具有重要临床价值[7]。本研究采用五色流式细胞术检测CWP患者外周血中性粒细胞、CD16+和CD16-单核细胞、细胞毒性T+NK等10余种细胞,探讨在CWP发生发展中其水平的变化,为CWP机制探究、临床诊断及治疗提供新思路。

1   对象与方法

1.1   研究对象

收集2015—2016年在开滦职业病防治院住院的CWP患者66例,均为按照GBZ 70—2009《尘肺诊断标准》确诊的壹期患者(CWP组)。年龄51~76岁,平均(61.23±4.29)岁。接尘年限8~39年,平均(30.45± 6.92)年;其中:接尘年限小于30年的27例,30年以上的39例。单纯壹期CWP患者54例,并发慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)12例。依据用力肺活量、第1秒用力呼气量、用力呼气1秒率(第1秒用力呼气量占用力肺活量百分率)、肺总量对壹期CWP患者肺功能分级,其中:肺功能正常30例,轻度障碍23例,中-重度障碍13例。接尘组为与CWP组相同接尘条件的井下接尘矿工47例,年龄54~78岁,平均(60.06±6.27)岁;接尘年限7~37年,平均(29.15±7.38)年。非接尘组为井上健康查体人员40例,年龄50~79岁,平均(60.55± 9.31)岁。所选研究对象均为男性,无心脑血管疾病、肾病、肝脏病、免疫系统疾病、内分泌系统疾病、肿瘤相关疾病及近期肺部感染等。

1.2   标本采集与处理

所有研究对象均清晨空腹采集静脉血2 mL于乙二胺四乙酸二钾真空采血管中,取血后迅速颠倒混匀,采集后4 h内处理分析。

1.3   主要仪器和试剂

FC500流式细胞仪和配套稀释液及清洗液、CytoDiff组合试剂(Beckman Coulter,美国),包含CD36-FITC、CD2-PE、CD294-PE、CD19-ECD、CD16-PC5和CD45-PC7六种单抗、溶血素、校准微球和质控微球。

1.4   检测方法

开机后先使用荧光微球完成仪器校准和补偿设定,符合要求可检测样本。试管内加入10 µL CytoDiff组合试剂与100 µL标本混匀,室温避光孵育15 min,加入溶血素1 mL混匀,室温避光孵育10 min后将样本按顺序置于进样架,打开仪器自动分析软件进行标本检测,每管收集20 000个细胞后由软件计算出各细胞百分比。

1.5   统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件进行资料分析,符合正态分布的计量资料以x±s表示,两均数间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析F检验,组间两两比较采用q检验;符合偏态分布的计量资料以MP25~P75表示,多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验,多组间两两比较采用Nemenyi检验,两组间比较采用Mann-Whitney U检验。检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   研究对象的一般特征比较

经统计学分析,3组研究对象的年龄、接尘年限、吸烟情况及工种分布的差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表 1

表1

研究对象的一般特征

2.2   外周血白细胞亚群变化

Kruskal-Wallis H检验结果显示,3组间的B淋巴细胞、细胞毒性T+NK细胞、总单核细胞、CD16-单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的差异有统计学意义(P < 0.05)。与非接尘组相比,CWP组B淋巴细胞、总单核细胞、CD16-单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞水平增高,差异有统计学意义(Z值分别为-2.327、-3.503、-3.415、-2.650和-3.282;P值分别为0.020、0.000、0.001、0.008和0.001);与接尘组相比,CWP组B淋巴细胞、嗜酸性粒细胞水平增高,细胞毒性T+NK细胞水平降低,差异有统计学意义(Z值分别为-2.298、-2.802和2.397;P值分别为0.022、0.005和0.017);接尘组细胞毒性T+NK细胞、总单核细胞、CD16-单核细胞水平高于非接尘组,差异有统计学意义(Z值分别为-2.104、-3.275和-3.177;P值分别为0.035、0.001和0.001);3组人群的中性粒细胞水平差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 2

表2

3组研究对象外周血白细胞亚群变化(%)

2.3   壹期CWP患者中吸烟与非吸烟者外周血白细胞亚群水平

与非吸烟者相比,吸烟的壹期CWP患者外周血总淋巴细胞、B淋巴细胞增高,成熟中性粒细胞降低,差异有统计学意义(Z值分别为-2.139、-2.419和-2.158,P值分别为0.032、0.016和0.031),其他指标间比较差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 3

表3

吸烟与否壹期CWP患者外周血白细胞亚群变化(%)

2.4   壹期CWP患者外周血白细胞亚群水平与其临床相关指标的关系

单纯CWP与并发COPD者比较、不同接尘年限者(以30年为界)比较,外周血白细胞亚群水平均无明显改变,差异无统计学意义(P > 0.05);肺功能正常、轻度异常和中-重度异常3组比较,外周血白细胞亚群水平也无明显改变,差异无统计学意义(P > 0.05)。

3   讨论

以往对单核细胞亚群的研究表明,单核细胞亚群具有比非促炎性的CD16-单核细胞、促炎性的CD16+单核细胞更强分泌促炎因子的能力,参与机体免疫调节及组织修复,并与感染和炎症性疾病密切相关[8]。本研究结果显示,与非接尘组相比,接尘组和CWP组总单核细胞、CD16-单核细胞水平升高,而CD16+单核细胞无明显变化。可能是因为在接尘期,粉尘刺激诱导边缘池蓄积的CD16+单核细胞快速释放至炎症部位,参与速发的固有免疫反应;而CD16-单核细胞在粉尘刺激下诱导分化为巨噬细胞,作为抗原提呈细胞参与适应性免疫反应[9]。工人发病之后,脱离开粉尘持续刺激的环境,细胞免疫反应有所减弱,CD16+单核细胞活力相应降低。国外研究者在对特发性肺纤维化患者的研究中也发现,CD16hi单核细胞/总单核细胞> 0.5%,提示预后不良,CD16hi单核细胞亚群百分比的增加与疾病进展相关[10]。这些研究结果提示,总单核细胞、CD16-单核细胞水平升高可能与粉尘刺激有关。

在淋巴细胞亚群研究中发现,CD19缺陷小鼠对博来霉素刺激的敏感性下降,而其高表达小鼠肺组织纤维化加重,可能通过控制渗透到肺组织中的B淋巴细胞调节肺纤维化的发生[11]。本研究结果显示,壹期CWP患者外周血B淋巴细胞高于接尘组和非接尘组,而接尘组与非接尘组相比,B淋巴细胞无异常,认为壹期CWP患者中B淋巴细胞介导体液免疫功能上调。细胞毒性CD8+T细胞可分化为2型细胞毒性T细胞,发挥重要作用[12]。石英可诱发矽肺模型大鼠的固有性免疫应答,NK细胞参与矽肺免疫调节过程[13]。本课题组以前的研究结果也显示,CWP患者CD16+CD56+NK明显下降,证实壹期CWP患者存在NK细胞免疫功能低下[4]。本研究结果显示,CWP组细胞毒性T+NK细胞水平低于接尘组,接尘组细胞毒性T+NK细胞水平高于非接尘组,可能因巨噬细胞吞噬粉尘颗粒后以一种抗原特异性方式刺激机体,导致细胞毒性T+NK细胞增殖,并可能通过释放穿孔素和颗粒酶至细胞间隙诱导靶细胞凋亡[14],而致肺纤维化后,细胞毒性T+NK细胞消耗过多,细胞免疫反应有所减弱。B淋巴细胞和细胞毒性T+NK细胞水平变化可能与CWP发生发展有关。

本研究中粒细胞亚群结果显示,从非接尘到接尘至尘肺纤维化,中性粒细胞水平无明显变化,可能为粉尘刺激诱导中性粒细胞募集入肺,在粉尘颗粒清除过程中尚不能导致中性粒细胞消耗性下降,而CWP组嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞水平比接尘组和/或非接尘组明显增高,这些变化可能在CWP的发生过程中起一定作用。尽管大多数时候中性粒细胞对宿主起有利作用,但在自身免疫或加剧的炎症反应中其异常的活化也可导致组织损伤[15]。矽尘刺激机体可导致中性粒细胞炎症和肉芽肿,引发矽肺的早期炎症[1]。而纯化的肺嗜酸性粒细胞能够刺激鼠肺成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白和胶原表达,加重博来霉素诱导的肺纤维化,在肺纤维化发生过程中发挥一定作用[16]。OH等[17]对嗜碱性粒细胞研究结果表明,嗜碱性粒细胞可通过细胞与细胞间的直接接触和分泌细胞因子两种途径促进初始CD4+T细胞向Th2方向分化,诱导机体启动Th2免疫应答。嗜碱性粒细胞可能通过诱导启动Th2免疫应答参与肺纤维化[18]

本次研究结果还显示,未成熟粒细胞、总原始细胞、原始T细胞、原始B细胞、原始非T非B细胞在3组间比较有统计学差异,原因可能为机体受粉尘刺激后大量炎症细胞募集至肺组织,骨髓造血功能促进未成熟细胞向成熟细胞转换所致,但更可能由于数量少而出现的统计学误差所致,统计结果缺乏客观性。由于未成熟细胞在外周血中含量甚微,需达到或超过一定量后才具有实际临床意义,其临床价值有待进一步探讨[19]

此外,在对壹期CWP吸烟与非吸烟患者外周血白细胞亚群水平进行分析时发现,壹期CWP吸烟患者总淋巴细胞、B淋巴细胞水平升高,成熟中性粒细胞降低,提示吸烟可能影响外周血白细胞亚群水平分布。可能吸入尼古丁后促进上皮和内皮细胞损伤,提高炎症细胞的集聚,进而刺激活性氧和胶原蛋白产生[20]。本课题组以前的研究也证实,吸烟可影响CWP患者CD4+T、CD8+T细胞水平,加重免疫紊乱程度,但CWP并发慢性支气管炎和肺气肿对外周血淋巴细胞CD4+、CD8+T水平无明显影响[2],此次本研究在对单纯CWP组及其并发COPD组外周血白细胞亚群水平分析时也发现,各白细胞亚群均无明显改变,白细胞亚群水平在接尘年限小于30年和大于30年组以及肺功能正常、轻度障碍及中重度障碍各组比较中也均无明显改变,可能在壹期CWP发生发展过程中,壹期CWP并发COPD对白细胞亚群水平无影响,白细胞亚群水平可能不因接尘时间的长短改变而改变,至于与T淋巴细胞不同亚群的变化不同[3],以及T淋巴细胞不同亚群与其肺功能降低有关[21]。可能因不同细胞类别、不同分群及不同方法所致,有待进一步研究。

通过对壹期CWP患者外周血白细胞亚群水平分析,认为总单核细胞和CD16-单核细胞水平升高可能与粉尘刺激有关,而嗜酸性粒细胞、B淋巴细胞水平、细胞毒性T+NK水平变化可能与CWP发生发展有关。吸烟可影响CWP患者体内白细胞亚群水平。

表1

研究对象的一般特征

Table 1
表2

3组研究对象外周血白细胞亚群变化(%)

Table 2
表3

吸烟与否壹期CWP患者外周血白细胞亚群变化(%)

Table 3

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[基金项目]

[作者简介] 袁宝军(1966-), 男, 硕士, 主任技师; 研究方向:临床免疫学检验及相关研究; E-mail: ybj25999@163.com

[收稿日期] 2017-08-15 00:00:00.0

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