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2022, 39(10):1095-1101.doi:10.11836/JEOM22189

GSK-3β调控DRP1在铝致原代海马神经元突起生长抑制中的作用


山西医科大学公共卫生学院,山西 太原 030001

收稿日期: 2022-05-15;  录用日期:2022-08-16;  发布日期: 2022-11-23

基金项目: 国家自然科学基金项目(81703202)

通信作者: 张慧芳, Email: zhf2008y@163.com  

作者简介: 李萌(1995—),女,硕士生;E-mail:2841319166@qq.com

[背景] 铝(Al)可对神经元以及突触功能造成不可逆的损伤,其机制可能与糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)调控动力相关蛋白1(DRP1)使线粒体损伤,致神经元突起生长抑制有关。

[目的] 探讨GSK-3β调控DRP1在Al致原代海马神经元突起生长抑制中的作用。

[方法] 取出生24 h以内的乳鼠海马提取神经元进行原代培养。培养至第6天,采用免疫荧光鉴定神经元纯度;培养至第10天,选择生长状态良好的神经元进行Al染毒以及GSK-3β抑制剂SB216763(SB)干预,实验分组为空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、Al组(20 μmol·L−1)、SB组(1 μmol·L−1)、SB(1 μmol·L−1)+Al(20 μmol·L−1)组。在干预原代海马神经元48 h后,采用CCK-8法检测神经元细胞活力,透射电子显微镜观察原代海马神经元线粒体形态,激光共聚焦成像对原代海马神经元进行扫描并分析其突起总长度,Sholl分析其复杂程度。采用蛋白印迹法检测原代海马神经元磷酸化GSK-3β、GSK-3β、DRP1蛋白表达水平。

[结果] 免疫荧光结果显示原代神经元的纯度大于90%。经Al染毒及SB干预48 h后,与空白对照组相比,DMSO组和SB组细胞存活率无明显差异(P>0.05),Al组明显降低(P=0.006);SB+Al组细胞存活率与Al组相比没有明显差异(P>0.05)。与空白对照组相比,DMSO组和SB组神经元平均突起总长无明显差异(P>0.05),Al组明显减少(P<0.001);SB+Al组神经元平均突起总长度明显高于Al组(P=0.001)。在距胞体130 μm以内,各组神经元的交叉点个数均随突起距离的增加而增加。在距胞体130 μm以上,各组神经元的交叉点个数均随突起距离的增加而逐渐减少。在距胞体130、310 μm处,与空白对照组相比,DMSO组与SB组神经元交叉点个数无明显差异(P>0.05),Al组明显减少(P<0.05);SB+Al组神经元交叉点个数与Al组无明显差异(P>0.05)。空白对照组线粒体结构完整,嵴清晰可见;DMSO组与SB组线粒体结构未见明显变化;Al组线粒体有明显破裂甚至成空泡化,嵴结构消失;SB+Al组与Al组相比嵴结构更清晰。各组间GSK-3β磷酸化水平差异具有统计学意义(F=45.841,P<0.001)。与空白对照组相比,DMSO组GSK-3β磷酸化水平无明显差异(P>0.05),SB组明显增加(P=0.022),Al组明显减少(P<0.001);SB+Al组GSK-3β磷酸化水平明显高于Al组(P<0.001)。各组间DRP1蛋白水平差异具有统计学意义(F=8.389,P=0.003)。与空白对照组相比,DMSO组和SB组DRP1蛋白水平无明显差异(P>0.05),Al组升高(P=0.001);SB+Al组DRP1蛋白水平明显低于Al组(P=0.029)。

[结论] Al可能通过激活GSK-3β,增加DRP1蛋白水平,致神经元线粒体损伤,进而抑制神经元突起生长。

关键词: 铝;  神经元;  突起;  线粒体;  糖原合成酶激酶-3β;  动力相关蛋白1 

铝(aluminium, Al)是自然界最常见的金属元素之一,人类可以通过多种途径与其接触[1]。长时间接触Al会对神经系统产生毒性作用,损伤学习与记忆功能[2]。神经系统的功能取决于神经元之间形成的连接以及这些连接应对外界刺激的结构重塑[3]。突起的形态可调节神经系统内信息的分布,神经元突起生长紊乱会导致神经发育缺陷和神经元疾病[4]。本课题组前期研究表明,Al可剂量依赖性地减少小鼠海马神经元细胞突起数量及长度,并伴随糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)活性的变化[5]。GSK-3β是神经元中一种重要的激酶,可通过Ser9位点磷酸化以抑制其自身活性[6]。GSK-3β通过对突触和树突棘结构可塑性的调控进而调节神经元的发育及突起生长,参与神经系统的学习记忆功能[7]。抑制GSK-3β的活性以及转染GSK-3β短发夹RNA(short hairpin, shRNA)下调GSK-3β均会诱导多个神经元轴突的形成[8]。研究指出GSK-3β对线粒体生物发生、线粒体生物能量、线粒体通透性和线粒体凋亡等具有调节作用[9]。线粒体参与真核生物的能量代谢,是满足神经元生长连续能量需求的必要条件[10]。动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1, DRP1)是调节线粒体分裂所必需的蛋白,其对维护线粒体结构的完整、线粒体膜的通透性有非常重要的作用[11]。DRP1下调可导致线粒体分裂障碍,影响线粒体三磷酸腺苷的生成,致线粒体功能障碍[12]。DRP1缺失将导致线粒体含量降低和海马树突神经元的树突密度降低[13]。闫靖等[14]的研究发现,将GSK-3β与DRP1的小干扰RNA质粒通过分子克隆的方法共转染到细胞之后,DRP1的表达量大幅度下调,GSK-3β对线粒体分裂的调控也明显受到抑制。因此推测GSK-3β可以通过调控DRP1的表达,引起线粒体过度分裂,致线粒体损伤,最终抑制神经元突起生长。

为探讨Al暴露引起神经元突起生长异常的具体分子机制,本研究拟采用原代海马神经元,利用Al染毒或通过抑制剂SB216763抑制GSK-3β活性进行干预,以线粒体为切入点,揭示GSK-3β在Al致神经元突起生长异常中的重要调控作用,为Al神经毒性的早期预防提供新的思路及理论依据。

1   对象与方法

1.1   动物、试剂和耗材

选择由健康成年雄性和雌性SD小鼠一起饲养后出生24 h内的乳鼠,小鼠由山西医科大学动物中心提供。主要试剂和耗材:胰蛋白酶消化液、D-Hanks缓冲液(武汉博士德)、Neurobasal-A培养液、B27添加剂(美国Gibco),多聚赖氨酸(美国Bio topped);麦芽酚、氯化铝(纯度为99%,美国Sigma-Aldrich)、SB216763(SB,上海碧云天);电镜固定液(武汉赛维尔)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2, MAP2)抗体(北京博奥森)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)液(北京索宝来);异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗小鼠IgG(北京博奥森);AF594标记的山羊抗小鼠IgG(杭州华安);蛋白抽提试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒,鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、正常小鼠IgG(上海碧云天);一抗磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)(Ser9)、GSK-3β、DRP1(江苏亲科生物)。

1.2   主要仪器

CO2恒温培养箱(美国Thermo Fisher),SW-CJ-2F型超净工作台(苏州安泰),Milli-Q Reference超纯水机(深圳贺裕),低速离心机(安徽中科中佳),酶标仪Modle 680(美国BIO-RAD),荧光显微镜(日本OLYMPUS),透射电子显微镜(日本HITACHI),激光共聚焦显微镜(日本OLYMPUS)。

1.3   实验方法

1.3.1   乳鼠原代海马神经元培养

出生24 h以内的20只乳鼠用75%(体积分数)的乙醇浸泡消毒后,用剪刀快速分离乳鼠身体,在无菌操作台下取出乳鼠大脑,放入用预冷的D-Hanks溶液润湿过的平皿上,快速分离双侧海马并切碎,加入0.125%(质量分数)的胰蛋白酶37 ℃消化15 min,放至培养基中终止消化。用200目(孔径0.075 mm)滤网过滤,200×g离心5 min,弃上清,加入含2%(体积分数)B27添加剂和100 U·mL−1双抗的无血清Neurobasal-A培养基重悬神经元细胞,将细胞悬液调为5×105个·mL−1,接种至12孔板内,放入培养箱培养。4 h后,更换培养液,以后每隔2 d换一次液。培养在第3天时,更换含2.55 μg·mL−1阿糖胞苷的新无血清培养液,以抑制非神经细胞的过度增殖。本研究已经山西医科大学实验动物中心伦理审批通过(编号:2021-335)。

1.3.2   免疫荧光化学鉴定神经元纯度

体外培养第6天的海马原代神经元,弃掉培养液,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次;用质量分数为4%的多聚甲醛室温固定30 min;用0.3%(体积分数)的Triton X-100冰上作用20 min;用5%(质量分数)的牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h后,加入MAP2一抗(1:200),4 ℃过夜,PBS洗涤;滴加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶200),37 ℃孵育1 h,PBS洗涤;滴加DAPI(1:1000),避光显色10 min,PBS充分洗涤;荧光显微镜下观察计数绿色荧光细胞占视野中总细胞数的比例,即为神经元纯度。

1.3.3   麦芽酚铝染毒及抑制剂干预后检测细胞活力

将氯化铝溶液和麦芽酚溶液等体积混合,配制成浓度为10 mmol·L−1的麦芽酚铝溶液,调节pH值至7.4左右;根据相关文献,GSK-3β的抑制剂SB溶于二甲基亚砜(DMSO)[15]。本次实验在神经元细胞培养至第10天时,将乳鼠的海马神经元接种于含多聚赖氨酸的96孔板中培养,选择生长状态良好的细胞进行麦芽酚铝染毒及SB干预48 h,实验分组为空白对照组、DMSO组、Al组(20 μmol·L−1)、SB组(1 μmol·L−1)、SB(1 μmol·L−1)+Al(20 μmol·L−1)组,每组设置3个复孔,48 h后吸弃旧的培养液,加入100 μL新的培养液和10 μL CCK-8溶液,培养箱中培养2 h。用酶标仪测定在450 nm处的光密度。

1.3.4   透射电镜观察神经元线粒体形态

离心收集细胞沉淀,至少为绿豆大小。吸取培养基加入电镜固定液,4 ℃重悬混匀固定2 h,经过琼脂预包埋、后固定、室温脱水、渗透包埋、聚合等步骤后,将树脂块切成60~80 nm超薄切片、染色,在透射电子显微镜下观察,采集图像分析。

1.3.5   免疫荧光观察神经元突起生长情况

将原代海马神经元接种于激光共聚焦专用平皿中进行培养。5~6 d后,选择生长状态良好的细胞进行染毒和干预,继续培养48 h,吸弃旧的培养液;每孔加入1 mL 4%(质量分数)多聚甲醛常温固定细胞20 min,PBS洗涤;用0.5%(质量分数)的Triton X-100冰上穿孔15 min,每孔1 mL,PBS洗涤;用5% BSA封闭30 min,每孔1 mL;吸掉封闭液,加入2% BSA稀释的MAP2一抗(1:200),4 ℃过夜;加入2% BSA稀释的MAP2二抗(1:500),37 ℃避光1 h,PBS洗涤;滴加DAPI溶液避光5 min后,PBS充分洗涤,每个皿中加入1 mL PBS,在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3.6   Sholl分析神经元突起复杂程度

利用ImageJ 1.8.0软件的Sholl分析插件对各组神经元形态进行定量分析。以神经元胞体中点为圆心,等间隔画一系列的同心圆。设定起始同心圆的半径为10 μm,半径间隔为30 μm,最大半径为310 μm。统计每个同心圆与神经元树突交叉点的数量,计算平均值及标准差并绘制折线图。Sholl分析时要确保神经元细胞在同一时间内进行培养、染毒及干预,并且细胞密度不能过多,防止其他神经元对其产生干扰。

1.3.7   蛋白印迹法检测p-GSK-3β、GSK-3β和DRP1蛋白水平

原代海马神经元经PBS漂洗后,加入放射免疫沉淀法裂解液提取蛋白,BCA法进行蛋白定量后稀释至同一浓度,加入5×上样缓冲液,煮沸5 min,−80 ℃保存以进行后续实验。将等量的样品(10 μL)上样,经凝胶电泳分离,转膜后,将膜放进5%的脱脂牛奶中,封闭3 h,加入一抗4 ℃孵育过夜,加入二抗37 ℃恒温1 h。用ECL超敏发光液显色,打开显影仪进行显影。使用Quantity one 4.6.6软件对蛋白条带进行光密度值分析,定量。

1.4   统计学分析

所有数据均用均数±标准差表示,用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析,采用单因素ANOVA分析组间的差异,两组间比较用LSD-t分析,检验水准α=0.05。

2   结果

2.1   Al对乳鼠原代海马神经元细胞活力的影响及SB的干预作用

培养神经元至第6天,免疫荧光结果表明神经元的纯度大于90%(图1)。与空白对照组相比,DMSO组和SB组细胞存活率没有明显的差异(P>0.05),Al组细胞存活率明显降低(P=0.006);SB+Al组细胞存活率与Al组相比没有明显差异(P>0.05)。结果见图2

图 1

原代海马神经元纯度鉴定

Figure1.

Purity evaluation of primary hippocampal neurons

A:蓝色为DAPI对细胞核染色;B:绿色为MAP2对神经元树突染色;C:DAPI和MAP2合并图片。 A: Blue is DAPI staining for nucleus; B: Green is MAP2 staining for neuronal dendrites; C: DAPI & MAP2 overlap.
图 2

Al和SB对原代海马神经元细胞存活率的影响( ${{\bar x} \pm s}$ n=3)

Figure2.

Effects of Al and SB on the cell viability rate of primary hippocampal neurons ( ${{\bar x} \pm s}$ , n=3)

a:与空白对照组相比,P<0.05;b:与DMSO组相比,P<0.05;c:与SB组相比,P<0.05。 a: Compared with the blank control group, P<0.05; b: Compared with the DMSO group, P<0.05; c: Compared with the SB group, P<0.05.

2.2   Al对乳鼠原代海马神经元平均突起总长度的影响及SB的干预作用

图3所示,Al或SB处理原代海马神经元48 h后,空白对照组神经元发出的突起与周围的神经元细胞连结紧密,相互间交织成网络状;与空白对照组相比,DMSO及SB组细胞形态无明显差异,Al组神经元突起退化、截断,网状结构稀疏;相较于Al组,SB+Al组神经元突起长度及数目有一定程度增加(图3A)。经统计分析,与空白对照组相比,DMSO组和SB组神经元平均突起总长度无明显差异(P>0.05),而Al组明显减少(P<0.001);SB+Al组神经元平均突起总长度明显高于Al组(P=0.001)(图3C)。

图 3

Al和SB对原代海马神经元突起生长的影响

Figure3.

Effects of Al and SB on the neurite growth of primary hippocampal neurons

A:激光共聚焦显微镜观察Al和SB作用后原代海马神经元形态,细胞核用DAPI标记为蓝色荧光;B:神经元树突用MAP2标记为红色荧光;C:Al和SB对原代海马神经元突起长度的影响;D:Al和SB对原代海马神经元突起交叉点个数的影响。a:与空白对照组相比,P<0.05;b:与DMSO组相比,P<0.05;c:与SB组相比,P<0.05;d:与Al组相比,P<0.05;神经元交叉点个数和平均突起长度均以$\bar x \pm s$表示,n=3。 A: Morphology of primary hippocampal neurons treated with Al or/ and SB under laser confocal microscopy, and blue is DAPI staining for nucleus; B: Red is MAP2 staining for neuronal dendrites; C: Effects of Al or/and SB on the length of neurite primary hippocampal neurons; D: Effects of Al or/and SB on the number of neuronal intersections in primary hippocampal neurons. a: Compared with the blank control group, P<0.05; b: Compared with the DMSO group, P<0.05; c: Compared with the SB group, P<0.05; d: Compared with the Al group, P<0.05. The number of neuronal intersections and average neurite length of neurons are expressed as $\bar x \pm s$, n=3.

2.3   Al对乳鼠原代海马神经元突起交叉个数的影响及SB的干预作用

Sholl分析结果显示(图3),在距离胞体130 μm以内,随着距离的增加,各组神经元交叉点个数均随之增加。在距离胞体130 μm处,与空白对照组相比,DMSO组、SB组神经元交叉点个数无明显差异(P>0.05),Al组明显减少(P<0.001); SB+Al组神经元交叉点个数与Al组无明显差异(P>0.05)。在距胞体130 μm以上,随着距离的增加,各组神经元交叉点个数逐渐减少。在距离胞体310 μm处,与空白对照组相比,DMSO组、SB组神经元交叉点个数无明显差异(P>0.05),Al组明显减少(P=0.007);SB+Al组神经元交叉点个数与Al组无明显差异(P>0.05)。结果见图3BD

2.4   Al对原代海马神经元线粒体的影响及SB的干预作用

空白对照组和DMSO组线粒体形态饱满,嵴结构完整;SB组神经元线粒体未见明显变化;Al组线粒体明显肿胀破裂甚至成空泡化(红色箭头所指),嵴结构消失;与Al组相比,SB+Al组内膜完整,嵴结构更清晰,线粒体有轻微的肿胀破裂(红色箭头所指),见图4

图 4

Al和SB对原代海马神经元线粒体结构的影响

Figure4.

Effects of Al or/and SB on the mitochondrial structure of primary hippocampal neurons

红色箭头表示线粒体有明显的破裂。 Red arrows indicate obvious rupture of mitochondria.

2.5   Al对乳鼠原代海马神经元GSK-3β磷酸化水平、DRP1蛋白水平的影响以及SB的干预作用

各组间GSK-3β磷酸化水平(p-GSK-3β蛋白水平与总GSK-3β蛋白水平的比值)差异具有统计学意义(F=45.841,P<0.001)。与空白对照组相比,DMSO组GSK-3β磷酸化水平无明显差异,SB组明显增加(P=0.022),Al组明显减少(P<0.001);SB+Al组GSK-3β磷酸化水平高于Al组(P<0.001)。各组间DRP1蛋白水平差异具有统计学意义(F=8.389,P=0.003)。与空白对照组相比,DMSO组、SB组DRP1蛋白水平无明显差异(P=0.958,P=0.774),Al组升高(P=0.001);SB+Al组DRP1蛋白水平明显低于Al组(P=0.029),见图5

图 5

Al和SB对原代海马神经元GSK-3β磷酸化水平、DRP1蛋白表达水平的影响

Figure5.

Effects of Al or/and SB on the GSK-3β phosphorylation level and DRP1 protein expression level of primary hippocampal neurons

A:相关蛋白免疫印记条带;B:Al和SB对原代海马神经元GSK-3β磷酸化水平的影响;C:Al和SB216763对原代海马神经元DRP1蛋白表达水平的影响。a:与空白对照组相比,P<0.05;b:与DMSO组相比,P<0.05;c:与SB组相比,P<0.05;d:与Al组相比,P<0.05;磷酸化水平及蛋白相对表达量均以${{\bar x} \pm s} $表示,n=3。 A: Related protein Western blotting bands; B: Effects of Al or/and SB on GSK-3β phosphorylation in primary hippocampal neurons; C: Effects of Al or/and SB on DRP1 protein expression in primary hippocampal neurons. a: Compared with the blank control group, P<0.05; b: Compared with the DMSO group, P<0.05; c: Compared with the SB group, P<0.05; d: Compared with the Al group, P<0.05. Phosphorylation level and relative protein expression level were expressed as ${{\bar x} \pm s}$, n=3.

3   讨论

众所周知,Al过量积存可导致人的认知功能损伤,并引发一系列神经退行性疾病[16]。近期研究指出,Al可透过血脑屏障进入脑海马区致神经突触结构及功能损伤[17-18]。Johnson等[19]的研究发现,Al可致原代海马神经元凋亡,并呈现一定的时间和剂量依赖性。本研究经激光共聚焦显微镜观察,可看到神经元突起交织成网状结构,与课题组前期研究一致,发现Al可致神经元突起分支数及长度降低,形态上扭曲断裂,影响神经元突起间网络结构与突触联系[5]。细胞突起是神经元的重要组成部分,其生长模式及形态的改变可能与神经退行性疾病有关[20],Al致神经元突起生长抑制的机制值得深入探讨。

神经元突起生长调控机制复杂,环境对其影响非常重要[21]。研究发现GSK-3β可以调节神经元的发育及突起的生长,并通过调控突触可塑性和树突棘结构可塑性参与学习记忆过程[22]。研究表明,酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)可以使GSK-3β的Ser9位点磷酸化水平上调而使GSK-3β失活,从而增加淀粉样蛋白β表达,进而抑制神经元突起的平均长度[23]。课题组前期研究证实Al诱导的神经元突起长度和分支数的减少受miR-29a及其靶神经元PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen,第10染色体同源丢失性磷)-GSK-3β信号通路的调控[24]。本次研究结果表明,Al可使GSK-3β磷酸化水平降低,即GSK-3β的活性增高。为了探讨GSK-3β在Al致神经元突起生长异常中的作用,采用SB进行干预,发现GSK-3β活性降低可以缓解Al引起的神经元突起生长抑制,提示GSK-3β可能是Al诱导神经元突起生长抑制的关键靶点。

神经元是高能量需求的细胞,线粒体是神经系统非常重要的供能细胞器,神经元突起的生长需线粒体提供能量[25]。但线粒体正常结构会因线粒体的过度分裂而遭到破坏,进而导致突触功能的损伤以及神经元功能下降[26]。本实验研究结果发现,空白对照组线粒体形态呈线状,嵴结构完整;而Al组线粒体明显肿胀破裂,嵴结构消失;SB干预后,线粒体的损伤程度降低,说明抑制GSK-3β活性可缓解Al引起的神经元线粒体损伤。这与他人的研究一致,例如Wang[27]的研究发现姜黄素通过抑制骨骼肌中的GSK-3β活性来缓解慢性肾脏病诱导的线粒体损伤和线粒体功能障碍。DRP1是已知的调节线粒体分裂最重要的蛋白之一[28]。在研究神经元细胞中发现,用小干扰RNA抑制DRP1表达之后,GSK-3β对线粒体分裂并没有发挥作用[14],提示在神经元中GSK-3β对线粒体分裂的调节作用是依赖DRP1的。本研究结果发现。当Al作用于神经元,GSK-3β活性升高,DRP1表达明显增多,意味着线粒体处于一个过度分裂的状态,会损害线粒体正常结构,使神经元功能下降,神经元生长受损[29]。有研究表明,在脑缺血损伤中,p38抑制可抑制GSK-3β的活化,下调DRP1的表达,减少线粒体的损伤[30]。本次研究结果对染Al神经元进行SB的干预后DRP1表达水平与Al组相比明显降低,线粒体损伤程度减轻,神经元平均突起总长度明显增加。

综上所述,Al可能通过GSK-3β调控DRP1从而引起线粒体损伤,并最终抑制神经元突起生长。研究结果可为Al毒性的早期预防提供新的思路及理论依据。

图 1

原代海马神经元纯度鉴定

Figure 1

Purity evaluation of primary hippocampal neurons

A:蓝色为DAPI对细胞核染色;B:绿色为MAP2对神经元树突染色;C:DAPI和MAP2合并图片。 A: Blue is DAPI staining for nucleus; B: Green is MAP2 staining for neuronal dendrites; C: DAPI & MAP2 overlap.
图 2

Al和SB对原代海马神经元细胞存活率的影响( ${{\bar x} \pm s}$ n=3)

Figure 2

Effects of Al and SB on the cell viability rate of primary hippocampal neurons ( ${{\bar x} \pm s}$ , n=3)

a:与空白对照组相比,P<0.05;b:与DMSO组相比,P<0.05;c:与SB组相比,P<0.05。 a: Compared with the blank control group, P<0.05; b: Compared with the DMSO group, P<0.05; c: Compared with the SB group, P<0.05.
图 3

Al和SB对原代海马神经元突起生长的影响

Figure 3

Effects of Al and SB on the neurite growth of primary hippocampal neurons

A:激光共聚焦显微镜观察Al和SB作用后原代海马神经元形态,细胞核用DAPI标记为蓝色荧光;B:神经元树突用MAP2标记为红色荧光;C:Al和SB对原代海马神经元突起长度的影响;D:Al和SB对原代海马神经元突起交叉点个数的影响。a:与空白对照组相比,P<0.05;b:与DMSO组相比,P<0.05;c:与SB组相比,P<0.05;d:与Al组相比,P<0.05;神经元交叉点个数和平均突起长度均以\begin{document}$\bar x \pm s$\end{document}表示,n=3。 A: Morphology of primary hippocampal neurons treated with Al or/ and SB under laser confocal microscopy, and blue is DAPI staining for nucleus; B: Red is MAP2 staining for neuronal dendrites; C: Effects of Al or/and SB on the length of neurite primary hippocampal neurons; D: Effects of Al or/and SB on the number of neuronal intersections in primary hippocampal neurons. a: Compared with the blank control group, P<0.05; b: Compared with the DMSO group, P<0.05; c: Compared with the SB group, P<0.05; d: Compared with the Al group, P<0.05. The number of neuronal intersections and average neurite length of neurons are expressed as \begin{document}$\bar x \pm s$\end{document}, n=3.
图 4

Al和SB对原代海马神经元线粒体结构的影响

Figure 4

Effects of Al or/and SB on the mitochondrial structure of primary hippocampal neurons

红色箭头表示线粒体有明显的破裂。 Red arrows indicate obvious rupture of mitochondria.
图 5

Al和SB对原代海马神经元GSK-3β磷酸化水平、DRP1蛋白表达水平的影响

Figure 5

Effects of Al or/and SB on the GSK-3β phosphorylation level and DRP1 protein expression level of primary hippocampal neurons

A:相关蛋白免疫印记条带;B:Al和SB对原代海马神经元GSK-3β磷酸化水平的影响;C:Al和SB216763对原代海马神经元DRP1蛋白表达水平的影响。a:与空白对照组相比,P<0.05;b:与DMSO组相比,P<0.05;c:与SB组相比,P<0.05;d:与Al组相比,P<0.05;磷酸化水平及蛋白相对表达量均以\begin{document}${{\bar x} \pm s} $\end{document}表示,n=3。 A: Related protein Western blotting bands; B: Effects of Al or/and SB on GSK-3β phosphorylation in primary hippocampal neurons; C: Effects of Al or/and SB on DRP1 protein expression in primary hippocampal neurons. a: Compared with the blank control group, P<0.05; b: Compared with the DMSO group, P<0.05; c: Compared with the SB group, P<0.05; d: Compared with the Al group, P<0.05. Phosphorylation level and relative protein expression level were expressed as \begin{document}${{\bar x} \pm s}$\end{document}, n=3.

参考文献

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(81703202)

[作者简介]

[收稿日期] 2022-05-15

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GSK-3β调控DRP1在铝致原代海马神经元突起生长抑制中的作用

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