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2022, 39(10):1089-1094.doi:10.11836/JEOM22126

基于单细胞转录组测序探索FABP5在矽肺纤维化中II型肺泡上皮细胞的特异性表达


a. 东南大学 公共卫生学院/环境医学工程教育部重点实验室 ;
b. 东南大学 医学院生理学系,江苏 南京 210000

收稿日期: 2021-04-05;  录用日期:2022-08-10;  发布日期: 2022-11-23

基金项目: 国家自然科学基金项目(81972987)

通信作者: 巢杰, Email: chaojie@seu.edu.cn  

作者简介: 杨少奇(1996—),女,硕士生;E-mail:1054224855@qq.com

[背景] 矽肺是由于长期吸入大量游离的二氧化硅(SiO2)颗粒所致,探讨其机制可以为矽肺纤维化的治疗提供新的方向。

[目的] 本研究着重探讨脂肪酸结合蛋白5(FABP5)在SiO2诱导的矽肺模型中的表达及发挥的作用。

[方法] 结合前期单细胞转录组测序结果,利用生物信息分析技术对小鼠肺泡上皮细胞进行分群并探索FABP5的表达模式;采用空间转录组学技术探索fabp5的分布模式。小鼠气管滴注SiO2建立矽肺纤维化模型,设置4个组别:生理盐水(normal saline, NS)7 d组、NS 56 d 组、SiO2 7 d组、SiO2 56 d组。SiO2处理小鼠肺上皮细胞系(MLE-12)建立矽肺体外模型。在动物整体水平,利用组织免疫荧光实验检测上皮细胞的标志物(E-Cad)和FABP5的蛋白水平;在体外水平,利用MLE-12验证细胞模型中fabp5 mRNA 表达变化和蛋白水平变化。

[结果] 单细胞转录组测序结果及空间转录组测序结果显示在小鼠矽肺病灶区域II型肺泡上皮细胞中fabp5 mRNA表达上调,伴随着组织免疫荧光蛋白水平升高,且与E-Cad存在共定位现象。同时SiO2刺激诱导MLE-12细胞中fabp5 mRNA表达升高至1.58倍和蛋白水平上升至2倍,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

[结论] 在肺纤维化模型的肺泡上皮细胞中,FABP5的蛋白水平上升,提示FABP5可能参与上皮细胞在肺纤维化病理进程。

关键词: 脂肪酸结合蛋白5;  矽肺;  单细胞转录组测序;  空间转录组测序 

矽肺是尘肺中最为常见的一种类型[1],是由于长期吸入大量游离二氧化硅(SiO2)粉尘所引起的肺纤维化疾病。由于早期缺乏筛检诊断的靶标,晚期缺乏特效的治疗措施,现在仍是我国面临最为严重的职业病之一,但其发病机制尚未阐释清楚,因此研究矽肺的发病机制至关重要。主流观点认为纤维化发生的主要原因是纤维细胞的活化、大量细胞外基质的积累、上皮细胞发生间质转化[2]。当游离SiO2颗粒进入肺泡后引发下呼吸道炎性细胞浸润,成纤维细胞异常增殖,肺泡上皮细胞表达释放多种细胞因子,促进成纤维细胞增生和胶原沉积,可以转分化为成纤维细胞,并在细胞因子刺激下向肌成纤维细胞转化[3]。对于矽肺动物模型的构建方法有很多,其中气管暴露法粉尘吸收充分、模型成功率高[4]。近年来,单细胞转录组测序技术得到了蓬勃发展,可以从单个细胞水平揭示全基因组范围内所有基因的表达情况,有利于研究细胞间的表达异质性。在肺部疾病研究中,单细胞转录组测序已经应用到特发性肺纤维化疾病[5],然而目前对于矽肺的研究未见报道。由于肺泡上皮细胞在肺中扮演着重要的角色,因此,课题组针对性地探究肺泡上皮细胞的异质性变化在矽肺疾病进程中是否起重要作用。文献报道脂肪酸结合蛋白5(fatty acid binding protein 5, FABP5)是重要的气道上皮细胞炎症相关蛋白[6]。FABP5在上皮间质转化[7]、脂质代谢、细胞增殖、侵袭[8]等方面发挥重要作用。本研究拟探索FABP5在矽肺纤维化进程中是否出现异常表达,及FABP5是否与矽肺纤维化的病理进程存在联系。

1   材料与方法

1.1   实验动物

采用6周龄、体重20~23 g的SPF级C57BL/6成年雄性小鼠(购于南京医科大学实验中心)构建矽肺模型。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(20 mg·mL−1,45 mg·kg−1)麻醉,动物呈仰卧位,颈部剃毛,皮肤经碘酒消毒后,暴露气管,经气管软骨环间隙注入50 mg·mL−1 SiO2悬液(Sigma,美国)0.1 mL后[9],立即将小鼠直立,轻微晃动小鼠2 min使药物均匀分布至双侧肺,缝合皮肤,局部消毒后继续饲养7 d和56 d作为SiO2模型组。正常健康小鼠气管注射生理盐水(normal saline, NS)作为对照组,各个组别保持相同的饲养条件。所有操作均符合东南大学动物伦理审查规定,编号为20190121002。

1.2   单细胞转录组测序

按“1.1实验动物”建立小鼠SiO2模型组;麻醉、固定、暴露气管、消毒灭菌等实验操作后,用手术刀剪开小鼠胸腔,将心脏暴露。用50 mL针管吸取约10 mL的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)后插入小鼠的左心室,缓慢且匀速地将PBS注入心脏进行灌流,当体内血液排完后停止PBS灌注;迅速取出小鼠肺组织,置于冰上,分离两侧肺叶后置于4 ℃预冷的PBS快速漂洗3遍;将全肺组织切为1 mm的小块,使用肺分离试剂盒(Miltenyi Biotech,德国)将其分离成单个细胞,交由中国北京博奥晶典生物技术公司进行单细胞转录组测序,结果已经上传至数据库GSE183682。

1.3   空间转录组测序

步骤同“1.2 单细胞转录组测序”,前期用PBS灌注鼠肺;迅速取出肺组织,剪取肺门水平的组织,根据需要的水平方向进行取材,干冰上用OCT包埋胶(Sakura,美国)进行包埋。−25 ℃下进行切片,当镜下观察到主支气管、肺动脉、肺静脉时,将所切取的肺组织放置在含有RNA捕获探针的玻片上,交由中国北京博奥晶典生物技术公司进行空间转录组测序,结果已经上传至数据库GSE183683。沿肺门方向的横切面切片,经过CT扫描确定纤维化病灶,获取病理切片。

1.4   小鼠肺组织免疫荧光

小鼠肺组织贴片后待其晾干5 min,PBS漂洗2次,每次8 min,去除多余OCT包埋胶(Sakura,美国);室温下4%(质量分数)多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗2次,每次5 min;使用0.1% Triton-X-100溶液(Biosharp,美国)室温处理30 min;使用封闭羊血清(Life Technologies,美国)室温封闭1 h;以1∶200的比例加入待测一抗,4 ℃,孵育过夜;PBS漂洗3次,每次5 min;以1∶200的比例加入荧光二抗,室温避光孵育2 h;PBS漂洗3次,每次8 min;使用防淬灭4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色封片液(Thermo,美国)封片,立即进行荧光显微镜拍照或4 ℃避光保存。

1.5   细胞培养

小鼠肺上皮细胞系(MLE-12)(ScienCell,美国),在含有10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基,5%二氧化碳和37℃的恒温箱(Termo Heracell 150iCO2孵化器,德国泰尔莫费希尔科技有限公司)环境中进行培养。

1.6   构建离体细胞模型

为了进一步验证单细胞转录组测序和空间转录组学结果,MLE-12细胞消化传代后,按每孔1×105个铺到24孔板中,待细胞贴壁以后,采用50 μg·cm2 SiO2刺激细胞,构建矽肺离体细胞模型,刺激0、1、3、6、12、24 h之后,收取细胞样品。

1.7   MLE-12细胞fabp5 mRNA表达量检测

用Trizol(Takara,日本)法提取MLE-12细胞RNA,进行逆转录反应,逆转录成为cDNA,之后进行实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)反应。引物序列见表1

表1

目的基因及内参基因的引物序列

Table1.

Primer sequence of target gene and internal reference gene

1.8   MLE-12细胞FABP5蛋白水平检测

利用蛋白免疫印记法检测蛋白水平,蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美国)转膜90 min,封闭1 h,孵育相应抗体于4 ℃冰箱过夜,孵育相应二抗后经增强型化学发光试剂(上海天能科技有限公司,中国),移动至凝胶成像曝光仪(上海天能科技有限公司,中国)显影。

1.9   数据库富集分析

根据单细胞转录组测序的结果,寻找II型肺泡上皮细胞(alveolar type 2 cells, AT2)在NS 56 d组与SiO2 56 d组的差异表达基因;打开微生信(www. bioinformatics.com.cn)在线分析,输入所得到的差异表达基因,进行基因本体(Gene Ontology, GO)数据库富集分析。

1.10   统计学分析

使用Graphpad prism 8.0统计分析各项实验数据和作图,每组数据以均值±标准差表示,多组样本间采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。使用ImageJ进行处理分析。

2   结果

2.1   fabp5在II型肺泡上皮细胞中差异性表达

根据矽肺单细胞转录组测序结果展示,将20个细胞群的标志基因可视化展示(图1),按照基因表达模式将AT2分为AT2-1亚型、AT2-2亚型和Igha+AT2亚型。本研究对前20的差异高表达基因进行GO富集分析得到这些差异高表达基因与肺纤维化有关,其中共同差异基因为fabp5。小提琴图展示了fabp5在所有细胞群中的变化,发现3个亚型的AT2中fabp5的表达情况不一致(图2)。

图 1

矽肺单细胞转录组测序标志基因气泡图展示

Figure1.

Bubble diagram display of silicosis single cell transcriptome sequencing marker genes

图 2

单细胞转录组测序中fabp5细胞总群中的小提琴图展示

Figure2.

Violin diagram display of fabp5 cell population in single cell transcriptome sequencing

2.2   fabp5在三个亚型的AT2中表达变化

相较于NS 56 d组,fabp5 mRNA均在SiO2 56 d组呈差异性高表达,变化倍数分别为1.03、2.66、2.65。小提琴图展示了在4个组别(NS 7 d、NS 56 d、SiO2 7 d、SiO2 56 d)中AT2中fabp5 mRNA的表达情况不同,其中在SiO2 56 d组中fabp5的表达上调(图3)。

图 3

AT2细胞亚型中fabp5不同表达模式的小提琴图展示

Figure3.

Violin diagram display of different expression patterns of fabp5 in AT2 cell subtypes

AT2细胞在4个组别的数量不一致(图4),其中在SiO2 56 d组中细胞数目的增多。柱状图展示了3个亚型AT2中fabp5表达阳性的细胞所占比例,在SiO2 56 d组占比分别为76.89%、66.07%、84.92%(图5)。

图 4

不同组别AT2细胞数量

Figure4.

The number of AT2 cells in different groups

图 5

fabp5表达阳性的AT2细胞所占全部AT2细胞的比例

Figure5.

The proportion of fabp5-positive AT2 cells in total AT2 cells

2.3   空间转录组测序结果

采用组织免疫荧光方法对小鼠肺组织切片染色,结果发现:NS 7 d和NS 56 d组小鼠未见渗出水肿等炎性改变,SiO2 7 d组有炎性浸润,SiO2 56 d组出现纤维化病灶区,部分肺泡结构丢失,胶原增加。空间转录组测序结果显示:在SiO2 56 d组发现阳性表达fabp5的AT2细胞区域和肺纤维化病灶区相吻合(图6)。

图 6

fabp5阳性表达的AT2细胞区域和肺纤维化病灶区

Figure6.

fabp5 positive expression in AT2 cell regions and pulmonary fibrosis lesions

上:HE染色,圈出部分为病灶区域;下:空间转录组学fabp5阳性表达的AT2细胞区域,圈出区域为阳性表达区域。 Upper: HE staining, circle indicates lesions; Lower: Spatial transcriptome sequencing, circle indicates fabp5 positive expression in AT2 cells.

2.4   离体实验中fabp5 mRNA表达变化和蛋白水平变化

qPCR结果显示,相较于0 h,6 h细胞内fabp5表达量升高至1.58 倍,且差异具有统计学意义(P<0.05)(图7)。蛋白免疫印记法结果发现FABP5的蛋白水平呈时间依赖性升高,在6 h时达到高峰,与0 h蛋白水平相比升高至2.02倍,且差异具有统计学意义(P<0.05)(图8)。

图 7

SiO2刺激MLE-12细胞不同时间后构建的离体模型中qPCR检测fabp5的mRNA表达

Figure7.

qPCR detection results of mRNA expression of fabp5 in the in vitro model of MLE-12 cells stimulated by SiO2 over time

*:与0 h相比, P<0.05。 *: Compared with 0 h, P<0.05.
图 8

SiO2刺激MLE-12细胞不同时间后构建的离体模型中蛋白免疫印记法检测FABP5的蛋白水平

Figure8.

Western blotting detection results of the protein levels of FABP5 in the in vitro model of MLE-12 cells stimulated by SiO2 over time

*:与0 h相比,P<0.05。 *: Compared with 0 h, P<0.05.

2.5   矽肺模型小鼠FABP5整体水平变化

组织免疫荧光结果发现矽肺小鼠肺组织结构紊乱,FABP5和肺上皮细胞的标志物E-Cad存在共定位,且FABP5的免疫荧光蛋白水平上调(图9)。

图 9

肺组织FABP5蛋白水平的免疫荧光显示

Figure9.

Immunofluorescence of FABP5 protein levels in lung tissues

3   讨论

矽肺是职业性尘肺病中常见的类型之一,是一种无法治愈的职业病,其病理特征是弥漫性肺纤维化。肺上皮细胞在矽肺发病机制中的扮演着重要的角色[10],它参与胶原形成,细胞外基质的恶性增生,导致肺发生广泛性的纤维化病变,从而产生呼吸受阻,进而引发一系列的并发症。

单细胞转录组测序可以揭示细胞群体间的差异和进化关系。本研究结果显示,在3个亚型的AT2中fabp5表达模式不一致。虽然在SiO2 56 d和NS 56 d两组间均存在表达差异,但是3个亚型关于fabp5表达模式不尽相同。在AT2-2和Igha+AT2中,在SiO2 56 d组fabp5阳性表达的细胞占比相较NS 56 d组高(分别为84.92%、66.07%)。FABP5水平在乳腺肿瘤中上调,促进细胞的增殖和转移[11],FABP5具有参与细胞增殖的功能。这两个亚型的AT2细胞数量在SiO2 7 d组都没有明显升高,但在SiO2 56 d组出现了升高,可能由于上皮细胞过度的增殖需要大量能量供应。fabp5阳性表达的AT2具体在矽肺纤维化阶段发挥何种功能是后续实验值得探讨的内容。

脂肪酸结合蛋白在体内分布很广,其主要作用是调节脂肪酸的摄取和胞内运输,参与调控细胞内脂肪酸的浓度,可以参与细胞内脂质代谢、信号转导和细胞生长等功能[12],SiO2刺激下,AT2中FABP5的蛋白水平上升,提示可能与肺纤维化存在关联。单细胞转录组测序结果可知fabp5的表达仅在SiO2 56 d组出现了差异高表达,在SiO2 7 d组升高不明显。相关文献报道FABP5可以作为脂质成纤维细胞的标志物[13],推测AT2可能由于高表达fabp5进而参与矽肺纤维化过程。

综上所述,在矽肺纤维化模型中,单细胞转录组测序分析结果发现在AT2中fabp5的表达上升,并通过整体动物实验和离体细胞实验进行了验证,提示FABP5可能参与上皮细胞在肺纤维化病理进程,为肺纤维化防治提供新的方向。

(志谢:本研究感谢东南大学江苏省重症医学重点实验室)

表1

目的基因及内参基因的引物序列

Table 1

Primer sequence of target gene and internal reference gene

图 1

矽肺单细胞转录组测序标志基因气泡图展示

Figure 1

Bubble diagram display of silicosis single cell transcriptome sequencing marker genes

图 2

单细胞转录组测序中fabp5细胞总群中的小提琴图展示

Figure 2

Violin diagram display of fabp5 cell population in single cell transcriptome sequencing

图 3

AT2细胞亚型中fabp5不同表达模式的小提琴图展示

Figure 3

Violin diagram display of different expression patterns of fabp5 in AT2 cell subtypes

图 4

不同组别AT2细胞数量

Figure 4

The number of AT2 cells in different groups

图 5

fabp5表达阳性的AT2细胞所占全部AT2细胞的比例

Figure 5

The proportion of fabp5-positive AT2 cells in total AT2 cells

图 6

fabp5阳性表达的AT2细胞区域和肺纤维化病灶区

Figure 6

fabp5 positive expression in AT2 cell regions and pulmonary fibrosis lesions

上:HE染色,圈出部分为病灶区域;下:空间转录组学fabp5阳性表达的AT2细胞区域,圈出区域为阳性表达区域。 Upper: HE staining, circle indicates lesions; Lower: Spatial transcriptome sequencing, circle indicates fabp5 positive expression in AT2 cells.
图 7

SiO2刺激MLE-12细胞不同时间后构建的离体模型中qPCR检测fabp5的mRNA表达

Figure 7

qPCR detection results of mRNA expression of fabp5 in the in vitro model of MLE-12 cells stimulated by SiO2 over time

*:与0 h相比, P<0.05。 *: Compared with 0 h, P<0.05.
图 8

SiO2刺激MLE-12细胞不同时间后构建的离体模型中蛋白免疫印记法检测FABP5的蛋白水平

Figure 8

Western blotting detection results of the protein levels of FABP5 in the in vitro model of MLE-12 cells stimulated by SiO2 over time

*:与0 h相比,P<0.05。 *: Compared with 0 h, P<0.05.
图 9

肺组织FABP5蛋白水平的免疫荧光显示

Figure 9

Immunofluorescence of FABP5 protein levels in lung tissues

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[基金项目] 国家自然科学基金项目(81972987)

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[收稿日期] 2021-04-05

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