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2022, 39(10):1146-1153.doi:10.11836/JEOM22044

IGF2BP3在MNNG致人胃上皮细胞恶性转化中的作用及机制


东南大学,公共卫生学院/环境医学工程教育部重点实验室,江苏 南京 210009

收稿日期: 2022-02-11;  录用日期:2022-08-16;  发布日期: 2022-11-23

基金项目: 国家自然科学基金面上项目(81972998)

通信作者: 梁戈玉, Email: lianggeyu@163.com  

作者简介: 任艺艺(1995—),女,硕士生;E-mail:220193557@seu.edu.cn

[背景] N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化修饰在环境致癌物诱发细胞恶性转化的过程中发挥着重要作用,但其作用及机制有待进一步探索。

[目的] 探究m6A结合蛋白中胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)在N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)致人胃黏膜上皮细胞GES-1恶性转化细胞中的作用及机制。

[方法] 基于MNNG致GES-1恶性转化细胞模型MC-30,应用转染慢病毒技术构建稳定敲低IGF2BP3的MC-30细胞株(MC30-shIGF2BP3,简写MC30-shI3),并设置阴性对照组(MC30-NC)。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blotting 实验分别检测IGF2BP3 mRNA和蛋白表达水平,RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RIP-qPCR)验证恶转细胞MC-30中IGF2BP3蛋白与MYC mRNA的结合,放线菌素D实验检测MYC mRNA的稳定性。CCK-8、Transwell分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力,Western blotting实验检测EMT关键蛋白(N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail)的表达。通过在MC30-shI3细胞中转染质粒过表达MYC的挽救实验,进一步观察细胞表型(增殖、迁移、侵袭)和EMT关键蛋白表达的变化来阐明下游靶基因MYC的作用。

[结果] 与对照组相比,5、10、20、40 μmol·L−1 MNNG染毒GES-1细胞后,IGF2BP3 mRNA表达均上调(P<0.05)。20 μmol·L−1 MNNG染毒GES-1细胞后,IGF2BP3 mRNA表达水平随染毒时间的延长呈上调趋势(P<0.05)。5 μmol·L−1 MNNG恶转第10、20、30代IGF2BP3 mRNA和蛋白表达水平均上调(P<0.05)。qRT-PCR和Western blotting 表明,与MC30-NC组相比,MC30-shI3组的细胞IGF2BP3 mRNA表达和蛋白表达水平明显下调(P<0.01);CCK8、Transwell表明,与MC30-NC组相比,MC30-shI3组的细胞增殖、迁移以及侵袭能力明显降低(P<0.01);Western blotting 实验表明,与MC30-NC组相比,MC30-shI3组的EMT关键蛋白N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表达水平均明显下调(P<0.01);RIP-qPCR结果显示,在MC-30细胞中,与IgG组相比,IGF2BP3组中富集的MYC的mRNA水平更高(P<0.01);放线菌素D实验表明,与MC30-NC组相比,MC30-shI3组MYC mRNA的稳定性明显降低(P<0.01)。挽救实验表明,与IGF2BP3敲低+质粒空载体组相比,IGF2BP3敲低+过表达MYC组的细胞MYC蛋白水平明显升高(P<0.01),细胞增殖、侵袭以及迁移能力均明显增强(P<0.01),EMT关键蛋白(N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail)的蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。

[结论] MNNG暴露可导致GES-1细胞中IGF2BP3表达上调;IGF2BP3可能通过与MYC mRNA相结合并增强其稳定性,增加其表达水平从而促进EMT进程,进而增强人胃上皮细胞恶性转化细胞的增殖、迁移和侵袭能力,影响恶性转化的进程。

关键词: N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍;  胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3;  GES-1细胞;  恶性转化;  上皮间质转化 

2020年,胃癌发病率和死亡率分别位居第五和第四,严重威胁着人类的健康[1]。胃癌是多病因、多阶段的复杂疾病,其发病受环境、遗传和表观遗传的共同影响,其中环境因素发挥着主要作用。流行病学研究表明,胃癌的发病率受到幽门螺杆菌感染、饮食、环境致癌物暴露等危险因素的影响[2],而环境致癌物已被确定为胃癌发生中最重要的因素之一[3]。其中,Ⅰ类致癌物N-亚硝基类化合物(N-Nitroso-compounds, NOCs)是一类与胃癌发展相关的强致癌物,广泛存在于食品和饮用水当中,尤其是腌制蔬菜、水产、肉类、啤酒及霉变食品,对人类健康构成很大威胁[4]。然而,其作用机制目前尚不十分清楚。N-甲基-N-硝基-N'-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)是NOCs机制研究中公认的模式化合物,常被作为模拟胃黏膜病变的致癌化学物质[5]。近来研究表明,表观遗传调控是MNNG作用的主要途径之一,但其所涉及的关键分子事件及其作用机制目前并不清楚。因此,针对MNNG诱发胃癌过程中的表观遗传关键分子及机制进行深入研究,对加快揭示NOCs环境化学致胃癌作用机制及防治具有重要的理论意义和应用价值。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修饰是真核生物中最常见的RNA修饰之一,参与调控转录后基因表达,与环境暴露相关疾病的发生和发展密切相关,为理解环境有害物质诱发胃部疾病的研究提供了新的视角[6]。m6A修饰是一个动态可逆的过程,由m6A甲基转移酶催化并由m6A去甲基化酶去除[7],m6A修饰RNA的命运和生物学功能主要依赖于m6A结合蛋白[8]。当暴露于环境毒物时,m6A甲基化水平和m6A调控因子的表达会随着时间和剂量依赖性方式发生变化,在各种环境毒物诱发的癌症中发挥关键作用。作为关键的m6A结合蛋白的胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3, IGF2BP3),在胃癌中高表达,增强了细胞增殖、侵袭和迁移的能力,显著促进了细胞恶性转化进程[9],可作为胃癌候选生物标志物[10]。然而,IGF2BP3在MNNG引起人胃黏膜上皮细胞GES-1恶性转化中的作用与机制尚不清楚。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是反映细胞恶性转化程度和侵袭转移能力的重要标志[11]。最新研究表明,m6A对暴露于环境化学物质后EMT和转移的发生至关重要[12]。然而,关于IGF2BP3能否激活MNNG诱导的GES-1细胞恶性转化的EMT进程,目前尚无报道。

MYC(也被称为c-myc)作为经典的原癌基因,已被视为肿瘤发生远处转移的重要分子标志[13]。此外,MYC在致癌物诱导细胞恶变过程中也发挥重要作用[14]。事实上,MYC还可通过调控EMT进程进而促进细胞转移[15]。相关研究表明,IGF2BP3在肿瘤细胞中通过m6A依赖的方式影响MYC mRNA稳定性,并影响MYC蛋白表达[16]。然而,关于IGF2BP3能否通过调控MYC mRNA稳定性激活MNNG诱导的GES-1细胞恶性转化的EMT进程,目前尚无报道。

因此,本研究基于已构建的MNNG致GES-1细胞恶性转化模型(MC细胞),探索IGF2BP3在恶转细胞中的功能和分子机制,以揭示MNNG所致细胞恶性转化的分子机制,为进一步理解化学致癌过程的分子机制和寻找胃癌的生物学标志提供一定的实验依据,为早期识别、预防和治疗胃癌提供新的思路。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   细胞株

人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞、MNNG诱导GES-1细胞恶性转化细胞模型(MC细胞),由东南大学环境医学工程教育部重点实验室提供。

1.1.2   主要材料

MNNG(麦克林,中国),敲低IGF2BP3慢病毒及相应的空载体(汉恒生物,上海),MYC过表达质粒及对应空载体(权阳生物,苏州),RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)试剂盒(Merck Millipore,美国),放线菌素D(Selleck,美国),CCK8试剂盒(美仑生物,中国),3422 transwell小室(Corning,美国),Matrigel基质胶(BD,美国),RNA提取及实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)相关试剂(Genestar,中国),WB实验一级抗体(CST,美国),WB内参抗体(鼠抗β-actin)(CST,美国)、二级抗体(HRP)(羊抗兔、羊抗鼠)(CST,美国)、ECL化学发光液(Merck Millipore,美国)。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1×105 U·L−1青霉素、100 mg·L−1 链霉素的培养基在37 ℃、5%CO2条件下常规培养细胞,细胞贴壁生长。

1.2.2   MNNG染毒处理

急性暴露:将人正常胃黏膜上皮细胞GES-1暴露于不同剂量MNNG(0、5、10、20、40 μmol·L−1)24 h;以20 μmol·L−1 MNNG处理GES-1细胞6、12、18、24和30 h。慢性暴露:构建恶性转化细胞株的MNNG染毒浓度为5 μmol·L−1,以5 μmol·L−1 MNNG处理GES-1细胞10、20、30、40代。

1.2.3   细胞转染慢病毒及质粒

将敲低IGF2BP3慢病毒载体及慢病毒空载体按照说明书进行慢病毒的转染;将MYC过表达及阴性对照质粒载体根据说明书进行质粒的转染。

1.2.4   qRT-PCR 检测细胞mRNA的表达

使用Trizol法提取总RNA,逆转录试剂盒逆转录合成互补DNA(complementary DNA, cDNA),采用SYBR Green PCR Master Mix进行qRT-PCR扩增,以β-actin作为内参,引物序列见表1。采用2−ΔΔCt法分析目的基因表达的相对差异。

表1

引物序列

Table1.

Primer sequences

1.2.5   Western blotting 实验检测细胞蛋白的表达

收集状态良好的细胞,提取总蛋白,蛋白质定量试剂盒法(bicinchonininc acid,BCA)测定总蛋白浓度。制备凝胶并上样,电泳,冰浴转膜,5%脱脂牛奶封闭,一抗4 ℃过夜孵育,TBST洗膜,二抗室温摇床孵育1 h,再次洗膜,用ECL显色系统和天能凝胶图像分析系统显色和分析各蛋白的表达情况,Image J软件(1.4.3.67)分析目的蛋白相对GAPDH的表达量。

1.2.6   CCK-8实验检测细胞增殖

按每孔3000个细胞的密度将细胞接种于96孔板中,每组6复孔。分别在贴壁生长12、24、48、72 h后,加入细胞增殖检测试剂(cell counting kit-8,CCK-8)避光孵育2 h。在酶标仪波长450 nm处检测光密度D值,分析数值并绘制生长曲线。

1.2.7   Transwell 实验

迁移实验:用不含FBS的培养基制备细胞悬液。将200 µL含15×105个细胞的细胞悬液加入Transwell小室,600 µL含20% FBS的培养基加至下室。培养12 h后,弃培养基,取出小室,甲醛固定,结晶紫染色后,用显微镜观察,计数。侵袭实验:需预先在Transwell上室铺Matrigel基质胶,将200 µL含50×105个细胞的细胞悬液加入Transwell小室,其他步骤同迁移实验。

1.2.8   RIP实验

RIP实验是根据RIP试剂盒说明书的标准实验步骤进行。最后,应用qRT-PCR检测MYC mRNA的水平,以IgG抗体拉取组,作为背景RNA含量的参照,即RIP实验阴性对照组。

1.2.9   放线菌素D实验

将细胞接种至6孔板,以相同的细胞培养条件进行培养,待细胞融合密度达80%以上时,每孔加入放线菌素D(actinomycin D, ActD)终质量浓度为2.5 μg·mL−1以终止RNA合成。在指定的时间点提取RNA,qRT-PCR检测细胞mRNA的表达。绘制mRNA半衰期曲线,观察mRNA降解速率的差异。

1.3   统计学分析

实验数据以平均数±标准差表示,应用SPSS 22.0软件进行统计分析。qRT-PCR结果采用2−ΔΔCt法进行数据分析。两组之间均数比较采用t检验,两组以上计量数据比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05(双侧)。

2   结果

2.1   IGF2BP3在MNNG急性暴露和慢性暴露致GES-1细胞恶性转化过程中的表达特征

急性暴露:与同剂量DMSO组相比,IGF2BP3的表达水平无明显差异(P>0.05),可排除DMSO的影响。与0 μmol·L−1对照组相比,不同浓度MNNG(5、10、20、40 μmol·L−1)染毒GES-1细胞24 h后,IGF2BP3表达水平均显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05),见图1A。这提示MNNG急性染毒可上调IGF2BP3的表达水平。为继续探索IGF2BP3表达水平与染毒时间的关系,使用20 μmol·L−1 MNNG对GES-1细胞进行不同时间的染毒,与6 h相比,除了12 h,随染毒时间的延长,IGF2BP3表达水平呈上调趋势(P<0.05),见图1B。此结果表明,IGF2BP3的表达随MNNG暴露时间的增加而上升。

图 1

MNNG急性暴露和慢性暴露对GES-1细胞IGF2BP3表达的影响

Figure1.

Effects of acute and chronic MNNG exposure on IGF2BP3 expression in GES-1 cells

A:不同浓度MNNG 急性暴露,IGF2BP3 mRNA表达量;B:20 μmol·L−1 MNNG不同时间急性暴露,IGF2BP3 mRNA表达量;C:5 μmol·L−1 MNNG慢性暴露,IGF2BP3 mRNA表达量;D:5 μmol·L−1 MNNG慢性暴露,IGF2BP3 蛋白表达水平。a:与0 μmol·L−1对照组相比,P<0.05;与6 h对照组相比,b:P<0.05,bb:P<0.01;与GES-1 组相比,*:P<0.05,**:P<0.01。

慢性暴露:与GES-1细胞相比,5 μmol·L−1 MNNG染毒10、20、30代的恶转细胞IGF2BP3 mRNA表达均上调(P<0.01),其中IGF2BP3在30代恶转细胞(MC-30细胞)中表达水平最高,上调3.57倍,见图1C。Western blotting 结果显示,与正常细胞相较,恶转10、20、30代IGF2BP3蛋白表达水平上调(P<0.05),而40代的恶转细胞蛋白表达与正常对照无明显差异(P>0.05),见图1D

2.2   成功构建稳定敲低IGF2BP3表达的恶转细胞株

本研究将敲低IGF2BP3的慢病毒以及慢病毒空载体转染至MC-30细胞中,并筛选敲低IGF2BP3稳转细胞株(MC30-shIGF2BP3,简写为MC30-shI3)和阴性对照稳转细胞株(MC30-NC)。荧光显微镜检测绿色荧光(ZsGreen)标记显示,MC30-shI3组和MC30-NC组稳转细胞株,转染效率均在95%,见图2A。同时,qRT-PCR结果显示,与空白对照组(MC30)或MC30-NC组相比,MC30-shI3组IGF2BP3 mRNA水平均下调(P<0.01),而MC30与MC30-NC组细胞IGF2BP3 mRNA表达水平无差异(P>0.05);Western blotting 结果与qRT-PCR结果一致,见图2B2C

图 2

构建稳定敲低IGF2BP3恶转细胞株MC30-shI3

Figure2.

Construction of stable IGF2BP3 knockdown MC30-shI3 cell lines

A:荧光显微镜检测绿色荧光(ZsGreen)标记;B:qRT-PCR检测MYC的mRNA表达水平;C:Western blotting检测MYC的蛋白表达水平。**:与MC30组或MC30-NC组相比,P<0.01。

2.3   IGF2BP3促进MC-30细胞的增殖、侵袭、迁移能力和EMT的进程

与MC30-NC组相较,MC30-shI3组细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显降低(P<0.01),见图3A~3C。与MC30-NC组相较,MC30-shl3组EMT关键蛋白N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表达水平下调,差异具有统计学意义(P<0.01),见图3D~3E

图 3

IGF2BP3对恶转细胞增殖、侵袭迁移能力以及EMT进程的影响

Figure3.

Effects of IGF2BP3 on proliferation, invasion, and migration abilities and EMT process of malignantly transformed cells MC-30

A:细胞增殖能力;B:细胞迁移和侵袭能力;C1、C2:每个视野的迁移、侵袭细胞数;D:EMT关键蛋白的表达;E:EMT关键蛋白表达的灰度值。**:与MC30-NC组相比,P<0.01。

2.4   IGF2BP3通过提高MYC mRNA的稳定性进而上调MYC的表达并成功构建MC30-shI3+MYC细胞株

与MC30或MC30-NC相比,MC30-shI3组MYC mRNA和蛋白水平均下调,且差异具有统计学意义(P<0.01),见图4A4B,提示抑制IGF2BP3可降低恶转细胞中下游MYC的表达。RIP-qPCR实验显示,与IgG组相比,IGF2BP3组中富集的MYC的mRNA水平明显更高,且差异具有统计学意义(P<0.01),见图4C,提示在恶转细胞中,IGF2BP3直接结合MYC。放线菌素D实验结果表明,与MC30-NC相比,MC30-shI3组细胞MYC mRNA稳定性明显下降(P <0.01),见 图4D,MC30-shI3组细胞MYC mRNA半衰期为72.45 min,MC30-NC组细胞MYC mRNA半衰期为94.29 min。

图 4

IGF2BP3和MYC之间的相互作用以及构建过表达MYC的细胞株

Figure4.

The interaction between IGF2BP3 and MYC and the construction of MYC over-expressed cells

A:MYC在稳定敲低IGF2BP3恶转细胞株中的mRNA表达水平;B:MYC在稳定敲低IGF2BP3恶转细胞株中的蛋白表达水平;C:RIP-qPCR实验结果;D:放线菌素D实验结果;E、F:EMT关键蛋白的表达水平。**:与MC30组相比,P<0.01;aa:与IgG相比,P<0.01;bb:与MC30-NC+vector组相比,P<0.01;cc:与MC30-shI3+vector相比,P<0.01。

将过表达MYC质粒以及空载体转染至MC30-shI3以及MC30-NC细胞中,分别构建在敲低IGF2BP3的恶转细胞中过表达MYC细胞株组(MC30-shI3+MYC)、IGF2BP3敲低阴性对照细胞株组(即IGF2BP3敲低+质粒空载体组,MC30-shI3+vector)以及空载体阴性对照细胞株组(慢病毒空载体+质粒空载体阴性对照组,即MC30-NC+vector)。Western blotting结果表明,与MC30-NC+vector组相比,MC30-shI3+vector组MYC蛋白表达水平下调(P<0.01);与MC30-shI3+vector相比,MC30-shI3+MYC组MYC蛋白表达得到恢复(P<0.01),见图4E4F

2.5   过表达MYC挽救IGF2BP3敲低对MC-30细胞增殖、迁移、侵袭能力和EMT过程的抑制作用

与MC30-NC+vector组相比,MC30-shI3+vector组细胞增殖、侵袭和迁移能力均降低(P<0.01);而与MC30-shI3+vector相比,MC30-shI3+MYC组细胞增殖、侵袭和迁移能力均提高(P<0.01),见图5A~5C。与MC30-NC+vector组相比,MC30-shI3+vector组N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表达水平降低(P<0.01);而与MC30-shI3+vector相比,MC30-shI3+MYC组EMT关键蛋白的表达水平均有所上升(P<0.01),见图5D5E

图 5

过表达MYC可挽救IGF2BP3敲低对恶转细胞MC-30增殖侵袭迁移、EMT进程的抑制作用

Figure5.

MYC overexpression could reverse the inhibition effects of IGF2BP3 knockdown on proliferation, invasion, and migration abilities and EMT process of malignantly transformed cells MC-30

A、B:细胞侵袭和迁移能力;C:细胞增殖能力;D、E:EMT关键蛋白的表达;**:与MC30-NC+vector组相比,P<0.01;##:与MC30-shI3+vector相比,P<0.01。

3   讨论

胃黏膜在各种致病因素的作用下会发生一系列的恶性改变,最终导致胃癌的发生,涉及多种基因和信号通路,然而,其发病机制尚不清楚[17]。MNNG诱导细胞恶性转化模型为探讨NOCs致胃癌的作用机理提供可能[18]。因此,本研究基于MNNG诱导GES-1细胞恶性转化模型开展研究,为尽早识别或减缓恶性转化过程提供依据。

MNNG诱导人胃正常黏膜细胞GES-1恶性转化会引起表观遗传的异常改变,导致胃癌的发生[19]。最新研究表明,暴露于环境毒物会导致m6A甲基化水平的异常并改变m6A调节因子的表达[20]。m6A结合蛋白IGF2BP3在胃癌中高表达,可能发挥致癌基因的作用[21]。在本研究中,我们发现暴露于致癌物MNNG可导致GES-1细胞中IGF2BP3表达的进行性上调,这表明IGF2BP3表达的改变不仅在胃癌形成之后,在细胞的恶性转化肿瘤形成之前就已经发生了改变,提示IGF2BP3表达的升高可能是暴露于MNNG后的早期事件。此外,敲低IGF2BP3显著抑制了恶转细胞的增殖、侵袭和迁移,提示IGF2BP3可能参与MNNG致GES-1细胞的恶性转化早期过程,发挥着类似致癌基因的作用。

细胞暴露于环境致癌物会在恶性转化过程中诱导EMT过程[22]。Cai等[23]研究表明,CCL2通过诱导EMT进程进而促进MNNG预处理GES-1细胞和MC细胞的迁移。本研究发现,敲低IGF2BP3后恶转细胞EMT关键蛋白N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail水平均降低,提示IGF2BP3可能通过调控EMT进程在环境致癌物诱发胃癌的过程中发挥着重要的作用。

IGF2BP3在肿瘤细胞中通过m6A依赖的方式影响MYC mRNA稳定性,并影响MYC蛋白表达[24]。本研究中,RIP-qPCR证实了恶转细胞中IGF2BP3蛋白与MYC mRNA的结合作用,同时MYC mRNA和蛋白的表达水平随IGF2BP3表达水平的降低而降低。放线菌素D实验结果提示抑制IGF2BP3会降低MYC mRNA的稳定性。以上研究结果共同表明,IGF2BP3通过直接结合MYC mRNA影响其稳定性进而影响其mRNA和蛋白的表达水平。此外,本研究通过挽救实验,观察到过表达MYC能够恢复敲低IGF2BP3对EMT进程的抑制作用,并且提高恶转细胞的增殖、侵袭迁移的能力,进一步提示IGF2BP3主要通过对MYC的调控促进EMT进程的分子机制。

本研究首次探讨了IGF2BP3在化学致癌过程中的功能和分子机制,揭示了IGF2BP3主要通过增强MYC稳定性促进EMT进程,影响细胞增殖、侵袭和迁移,从而促进MNNG对胃上皮细胞恶性转化过程的分子机制。然而,本研究还存在一定不足之处:研究仅通过体外细胞实验探究IGF2BP3在人胃上皮细胞恶性转化进程中的作用与机制,有待通过体内动物实验进一步探讨IGF2BP3对恶转细胞的致瘤性以及转移能力的影响。

综上所述,IGF2BP3可识别并结合MYC,增加MYC mRNA的稳定性,进而激活恶转细胞EMT进程,从而促进细胞的恶性转化,研究结果为探究环境致癌物MNNG诱导胃癌发生的调控机制、早期识别和预防提供新的思路和科学依据。

表1

引物序列

Table 1

Primer sequences

图 1

MNNG急性暴露和慢性暴露对GES-1细胞IGF2BP3表达的影响

Figure 1

Effects of acute and chronic MNNG exposure on IGF2BP3 expression in GES-1 cells

A:不同浓度MNNG 急性暴露,IGF2BP3 mRNA表达量;B:20 μmol·L−1 MNNG不同时间急性暴露,IGF2BP3 mRNA表达量;C:5 μmol·L−1 MNNG慢性暴露,IGF2BP3 mRNA表达量;D:5 μmol·L−1 MNNG慢性暴露,IGF2BP3 蛋白表达水平。a:与0 μmol·L−1对照组相比,P<0.05;与6 h对照组相比,b:P<0.05,bb:P<0.01;与GES-1 组相比,*:P<0.05,**:P<0.01。
图 2

构建稳定敲低IGF2BP3恶转细胞株MC30-shI3

Figure 2

Construction of stable IGF2BP3 knockdown MC30-shI3 cell lines

A:荧光显微镜检测绿色荧光(ZsGreen)标记;B:qRT-PCR检测MYC的mRNA表达水平;C:Western blotting检测MYC的蛋白表达水平。**:与MC30组或MC30-NC组相比,P<0.01。
图 3

IGF2BP3对恶转细胞增殖、侵袭迁移能力以及EMT进程的影响

Figure 3

Effects of IGF2BP3 on proliferation, invasion, and migration abilities and EMT process of malignantly transformed cells MC-30

A:细胞增殖能力;B:细胞迁移和侵袭能力;C1、C2:每个视野的迁移、侵袭细胞数;D:EMT关键蛋白的表达;E:EMT关键蛋白表达的灰度值。**:与MC30-NC组相比,P<0.01。
图 4

IGF2BP3和MYC之间的相互作用以及构建过表达MYC的细胞株

Figure 4

The interaction between IGF2BP3 and MYC and the construction of MYC over-expressed cells

A:MYC在稳定敲低IGF2BP3恶转细胞株中的mRNA表达水平;B:MYC在稳定敲低IGF2BP3恶转细胞株中的蛋白表达水平;C:RIP-qPCR实验结果;D:放线菌素D实验结果;E、F:EMT关键蛋白的表达水平。**:与MC30组相比,P<0.01;aa:与IgG相比,P<0.01;bb:与MC30-NC+vector组相比,P<0.01;cc:与MC30-shI3+vector相比,P<0.01。
图 5

过表达MYC可挽救IGF2BP3敲低对恶转细胞MC-30增殖侵袭迁移、EMT进程的抑制作用

Figure 5

MYC overexpression could reverse the inhibition effects of IGF2BP3 knockdown on proliferation, invasion, and migration abilities and EMT process of malignantly transformed cells MC-30

A、B:细胞侵袭和迁移能力;C:细胞增殖能力;D、E:EMT关键蛋白的表达;**:与MC30-NC+vector组相比,P<0.01;##:与MC30-shI3+vector相比,P<0.01。

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[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(81972998)

[作者简介]

[收稿日期] 2022-02-11

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IGF2BP3在MNNG致人胃上皮细胞恶性转化中的作用及机制

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